GD2

Nature Band 603, Seiten 934–941 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Das diffuse intrinsische pontine Gliom (DIPG) und andere H3K27M-mutierte diffuse Mittelliniengliome (DMGs) sind allgemein tödliche pädiatrische Tumoren des Zentralnervensystems1. Wir haben zuvor gezeigt, dass das Disialogangliosid GD2 auf H3K27M-mutierten Gliomzellen stark exprimiert wird, und haben eine vielversprechende präklinische Wirksamkeit von GD2-gerichteten chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen gezeigt2, was die Begründung für eine erste klinische Phase-I-Studie am Menschen liefert (NCT04196413). Da eine durch CAR-T-Zellen induzierte Hirnstammentzündung zu obstruktivem Hydrozephalus, erhöhtem Hirndruck und gefährlichen Gewebeverschiebungen führen kann, wurden Vorsichtsmaßnahmen für die neurokritische Pflege einbezogen. Hier präsentieren wir die klinischen Erfahrungen der ersten vier Patienten mit H3K27M-mutiertem DIPG oder Rückenmarks-DMG, die mit GD2-CAR-T-Zellen in Dosisstufe 1 (1 × 106 GD2-CAR-T-Zellen pro kg intravenös verabreicht) behandelt wurden. Patienten, die einen klinischen Nutzen zeigten, hatten Anspruch auf nachfolgende GD2-CAR-T-Zell-Infusionen, die intrazerebroventrikulär verabreicht wurden3. Die Toxizität hing größtenteils mit der Lokalisation des Tumors zusammen und war mit intensiver unterstützender Behandlung reversibel. Es wurde keine On-Target-Toxizität außerhalb des Tumors beobachtet. Drei von vier Patienten zeigten eine klinische und radiologische Verbesserung. Die Konzentration proinflammatorischer Zytokine war im Plasma und in der Liquor cerebrospinalis erhöht. Transkriptomanalysen von 65.598 Einzelzellen aus CAR-T-Zellprodukten und Liquor cerebrospinalis verdeutlichen die Heterogenität der Reaktion zwischen Teilnehmern und Verabreichungswegen. Diese ersten Ergebnisse unterstreichen das Versprechen dieses Therapieansatzes für Patienten mit H3K27M-mutiertem DIPG oder Rückenmarks-DMG.

Diese Phase-I-Dosisskalationsstudie mit autologen GD2-CAR-T-Zellen (die eine GD2-Bindungsdomäne, eine kostimulatorische 4-1BB-Domäne und eine CD3Ζ-Signaldomäne enthalten) bei Kindern und jungen Erwachsenen mit Pons- und Rückenmarks-DMG, gekennzeichnet durch ein K27M Die Mutation in Genen, die für Histon H3 (H3K27M) kodieren, wurde mit dem Hauptziel entwickelt, die Machbarkeit der Herstellung, Sicherheit und Verträglichkeit zu bewerten und die maximal verträgliche Dosis oder empfohlene Phase-II-Dosis zu ermitteln (Abb. 1a, b). Die Beurteilung der klinischen Aktivität war ein sekundäres Ziel und die Identifizierung von Biomarkern für die Reaktion war ein exploratives Ziel. Wir erwarteten die Entwicklung neurologischer Symptome im Zusammenhang mit CAR-T-Zell-vermittelten Entzündungen an Stellen mit Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS)2, die wir als Tumorentzündungs-assoziierte Neurotoxizität (TIAN) bezeichnet haben. Um die mit TIAN verbundenen Risiken zu mindern, haben wir Patienten mit großen Thalamus- oder Kleinhirntumoren ausgeschlossen, die Platzierung eines Ommaya-Reservoirs bei Patienten mit DIPG zur Überwachung des Hirndrucks (ICP) vorgeschrieben und einen TIAN-Toxizitätsmanagement-Algorithmus eingeführt, der die Entfernung von Liquor (CSF) beinhaltet ) über Ommaya, hypertone Kochsalzlösung, Antizytokinmittel und Kortikosteroide.

a, GD2–4-1BB–CD3Ζ CAR-Schema. TM, Transmembrandomäne. b, Überblick über das Design klinischer Studien. D0, Tag 0; LD, lymphodepletierende Chemotherapie. c, Obduktion von Teilnehmer 1 mit DIPG (DIPG-1). Von links nach rechts: Hämotoxylin- und Eosin-Färbung; CD3-Immunhistochemie (braun); GD2-CAR-mRNA-Punkte (rosa; Hämatoxylin-Gegenfärbung für alle Zellen in blau); und GD2-Antigen (blau) Immunhistochemie (H3K27M+-Kerne in braun). d, qPCR für GD2-CAR-DNA aus Autopsieproben von DIPG-1 zeigt das Vorhandensein von GD2-CAR im tumorbefallenen Mittelhirn und Pons, nicht jedoch im unbeteiligten Kortex oder Hirngewebe einer unbehandelten Person (Kontrolle). Der resezierte Temporallappentumor von Patient 1 mit spinalem DMG (spinalem DMG-1) nach intravenöser Infusion zeigt das Vorhandensein von GD2-CAR-DNA. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar, n = 3 technische Replikate für jede Probe. e, MRT-Scan (axiales T2, dargestellt auf Höhe des unteren Pons) von Teilnehmer 2 mit DIPG (DIPG-2) vor und 4 Wochen nach der intravenösen Infusion (obere Reihe). Ein MRT-Scan vor und 2 Wochen nach der icv-Infusion ist ebenfalls abgebildet (untere Reihe). Nach jeder Infusion ist eine Verringerung der Tumorgröße zu beobachten (rote Pfeile). f, Fotos von DIPG-2 zeigen eine signifikante Verbesserung der linken Gesichtskraft 2 Wochen nach der icv-Infusion. Die Fotos wurden mit Einverständniserklärung aufgenommen und veröffentlicht. Schaltpläne wurden mit BioRender.com erstellt.

Quelldaten

Ab Juni 2020 wurden vier Teilnehmer in der Dosisstufe 1 (DL1; 1 × 106 GD2-CAR-T-Zellen pro kg intravenös verabreicht; drei Teilnehmer mit DIPG und ein Teilnehmer mit Rückenmarks-DMG; 5–25 Jahre alt; ein männlicher und drei weiblich; Ergänzungstabelle 1); Bei allen Teilnehmern waren mehr als 6 Monate nach Abschluss der Standard-Strahlentherapie vergangen. GD2-CAR-T-Zellen wurden erfolgreich hergestellt und erfüllten die Freisetzungskriterien für alle vier Patienten (Ergänzungstabelle 2). Während der Zellherstellung kam es bei Patient 1 mit spinaler DMG zu einer schnellen Tumorprogression und er wurde aus der Studie entfernt, aber im Rahmen einer Einzelpatienten-Compassionate Emergency Investigational New Drug Application (eIND) bei DL1 behandelt. Die Ergebnisse werden hier mit einem Datenschnitt von März 2021 gemeldet.

Patientin 1 mit DIPG war ein 14-jähriges Mädchen mit H3K27M+ DIPG, das zum Zeitpunkt der Behandlung frühe radiologische Anzeichen einer Tumorprogression, eine Lähmung des rechten sechsten Nervs, eine linke Gesichtsschwäche, Dysarthrie, bilaterale Dysmetrie und einen breiten Gang aufwies. Am Tag +6 nach der intravenösen Behandlung mit GD2-CAR-T-Zellen (iv) erlitt sie ein Zytokinfreisetzungssyndrom (CRS; 40,1 °C Fieber) Grad 1 zusammen mit einer Verschlechterung der Hirnnervensymptome im Einklang mit TIAN und wurde mit Tocilizumab (einem IL-) behandelt. 6-Antagonist) und Kortikosteroide (Ergänzungstabelle 3). Am Tag +9 erlebte sie eine akute Episode von Fieber, Bluthochdruck, verminderter Reaktionsfähigkeit, Hemiplegie und Streckhaltung. Auf ihre Ommaya wurde sofort zugegriffen; Ihr ICP war auf 22 mmHg erhöht, 10 ml Liquor wurden abgelassen und sie kehrte innerhalb von Minuten zu ihrem neurologischen Ausgangswert zurück. Anakinra (ein IL-1R-Antagonist) wurde gestartet. Im MRT zeigte sich ein erhöhtes Ponsödem. Sie nahm weiterhin Kortikosteroide ein und verzeichnete eine vorübergehende Verbesserung ihrer Ausgangswerte für Dysarthrie und Dysmetrie. Einen Monat nach der Infusion war im MRT eine zunehmende Erkrankung (ca. 20 % Vergrößerung) erkennbar, gefolgt von einer Tumorprogression mit Todesfolge, 3 Monate nach der Infusion von GD2-CAR-T-Zellen, 3 Monate nach der ersten radiologischen Feststellung einer Progression und 13 Monate nach der Diagnose (Erweiterte Daten Abb. 1a, b). Die postmortale Gehirnuntersuchung zeigte eine erhebliche Infiltration von Lymphozyten im Tumor, die für DIPG4 untypisch ist; In Bereichen des normalen Gehirns wurde keine lymphatische Infiltration beobachtet (Abb. 1c, erweiterte Daten, Abb. 1c). RNAscope identifizierte Zellen, die das GD2-CAR-mRNA-Transkript im Tumor exprimierten, nicht jedoch im nicht betroffenen Kortex (Abb. 1c, erweiterte Daten Abb. 1d). In ähnlicher Weise wurde das GD2-CAR-Transgen durch quantitative PCR (qPCR) von DNA aus Tumorgewebe nachgewiesen (Abb. 1d). Die GD2-Antigen-Expression war im Tumor wesentlich höher als im normalen Hirngewebe (Abb. 1c, Extended Data Abb. 1e). Die Infiltration von Tumor-Mikrogliazellen und anderen myeloischen Zellen war deutlich zu erkennen (Erweiterte Daten, Abb. 1f, g).

Patient 2 mit DIPG war ein 21-jähriger Mann mit H3K27M+ DIPG, der zum Zeitpunkt der Aufnahme erste Anzeichen einer klinischen und radiologischen Progression aufwies, mit Lähmung des linken sechsten Nervs, Schwäche im linken Gesicht, verminderter Empfindung im linken Gesicht, Trismus mit Schwierigkeiten beim Öffnen des Mundes Dies begrenzte große Essensbissen, einen sensorischen Verlust der rechten unteren Extremität und einen Breitgang mit der Unfähigkeit, im Tandem zu gehen. Am Tag +7 nach der iv-Gabe von GD2-CAR-T-Zellen entwickelte er CRS Grad 2 (Fieber bis 39,4 °C und Hypotonie als Reaktion auf Flüssigkeiten) und eine vorübergehende Verschlechterung der Ausgangsdefizite, die mit TIAN vereinbar sind und die Brückenfunktion beeinträchtigen, einschließlich eines vorübergehend verschlechterten Trismus, der die orale Aufnahme einschränkt zum Essen durch einen Strohhalm, vorübergehender Sensibilitätsverlust der rechten oberen Extremität und leichter Hörverlust der linken Extremität, der 2 Tage anhält. Die MRT zeigte ein erhöhtes T2/FLAIR-Signal im linken Trigeminuskern (Extended Data Abb. 2a), das die Kaumuskulatur steuert und mit dem Symptom Trismus korreliert. Er wurde mit Tocilizumab und Anakinra, jedoch ohne Kortikosteroide behandelt (Ergänzungstabelle 3). In der zweiten Woche erlebte er eine deutliche Verbesserung des Trismus (nahezu normale Mundöffnung und keine Einschränkungen beim Essen), eine Verbesserung der Gesichtssymmetrie, eine Auflösung des anfänglichen sensorischen Verlusts und eine Verbesserung des Gangs mit der Fähigkeit, im Tandem zu gehen (Ergänzungstabelle 4). Einen Monat nach der Behandlung mit GD2-CAR-T-Zellen zeigte er eine nahezu normale neurologische Untersuchung mit nur einer verbliebenen Lähmung des sechsten Nervs. Die MRT zeigte Bereiche mit verbessertem T2/FLAIR-Signal und leicht verringertem (ca. 17 % kleinerem) Tumorvolumen (Abb. 1e, erweiterte Daten Abb. 2b).

Die klinische und radiologische Besserung hielt an, bis nach zwei bis drei Monaten die vorherigen Symptome wieder auftraten, einschließlich der Rückkehr des Trismus, Gesichtsschwäche und sensorischer Verlust, linker Hörverlust, verstärkte Schwäche und sensorischer Verlust auf der rechten Körperseite sowie Ganginstabilität Das erforderte die Nutzung eines Rollstuhls für alle Entfernungen über ein paar Schritte hinaus. Er erhielt eine zweite Dosis von 30 × 106 GD2-CAR-T-Zellen, die intrazerebroventrikulär (icv) über das Ommaya-Reservoir ohne Lymphodepletion verabreicht wurden. Er entwickelte innerhalb von 24 Stunden Fieber (40 °C) und etwa 48 Stunden nach der Infusion entwickelte er eine akut erhöhte Schläfrigkeit und eine neue Lähmung des rechten dritten Nervs. Der Zugang zu seinem Ommaya-Reservoir ergab einen erhöhten ICP von 34 mmHg; Der Liquor wurde mit sofortiger klinischer Besserung entfernt. Neuroimaging zeigte einen obstruktiven Hydrozephalus aufgrund der Kompression des vierten Ventrikels durch die ausgedehnte Pons. Der Zugang zum Ommaya blieb für eine kontinuierliche CSF-Entwässerung bestehen. Es wurden hypertone Kochsalzlösung, Anakinra und systemische Kortikosteroide verabreicht (Ergänzungstabelle 3). Der Hydrozephalus verschwand nach 2 Tagen, ohne dass eine weitere Liquordrainage erforderlich war. Kortikosteroide wurden nach 4 Tagen (am Tag +6) abgesetzt. Zwei Wochen nach der icv-Infusion hatte sich seine neurologische Untersuchung deutlich verbessert, mit einer nahezu Normalisierung der Gesichtskraft (Abb. 1f) und des Gesichtsgefühls, verbessertem Trismus, Hörvermögen, rechtsseitiger Schwäche und einer dramatischen Verbesserung des Gangs, die unabhängiges Gehen über weite Strecken ermöglichte (Ergänzungsvideos 1, 2, Ergänzungstabelle 4). Eine MRT-Untersuchung zwei Wochen nach der intravenösen GD2-CAR-T-Zell-Infusion zeigte eine Reduzierung des Tumorvolumens um 27 % im Vergleich zu seinem MRT vor der intravenösen Infusion (Abb. 1e, erweiterte Daten Abb. 2b).

Nach der Datenunterbrechung vom März 2021 erhielt er drei weitere icv-Infusionen (insgesamt fünf Infusionen). Vor der geplanten sechsten Infusion starb er an einer intratumoralen Blutung in einem bekannten Bereich mit intratumoraler Gefäßanomalie. Solche intratumoralen Blutungen kommen bei DIPG relativ häufig vor und das Risiko steigt mit der Zeit ab der Diagnose5. Er überlebte 26 Monate nach der Diagnose, 12 Monate nach Beginn der radiologischen und klinischen Progression und 10 Monate nach seiner ersten GD2-CAR-T-Zell-Infusion.

Patientin 3 mit DIPG war ein 5-jähriges Mädchen mit H3K27M+ DIPG, das vor der Progression in die Studie aufgenommen wurde. Sie wies keine Hirnstammvergrößerung auf, sondern nur Bereiche mit infiltrativem Tumor, die als fleckiges, abnormales T2/FLAIR-Signal im linken Hirnstiel (motorische Fasern des Kortikospinaltrakts) des Mittelhirns (Abb. 2a), der vorderen Brücke, der Medulla und dem linken Kleinhirnstiel erkennbar waren. Zu Studienbeginn zeigte sie eine beidseitige Gesichtsschwäche, eine hypophone Stimme, eine Abweichung der Zunge nach rechts, Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Mundsekrete (Sabbern), chronische Übelkeit, eine hypertone rechte Hemiparese, die die Nutzung des rechten Arms und der rechten Hand einschränkte (ihre rechte Hand wurde in einer gebeugten Position gehalten); Abb. 2b), Dysmetrie und ein hemiparetischer, breitbasiger Gang. Am Tag 7 nach der iv-Gabe von GD2-CAR-T-Zellen entwickelte sie CRS Grad 1 (Fieber von 40,4 °C) und vorübergehend erhöhte Ataxie, was mit TIAN übereinstimmt. Sie wurde mit Tocilizumab und Anakinra, jedoch ohne Kortikosteroide behandelt (Ergänzungstabelle 3). Zwei Wochen nach der Infusion war ihre chronische Übelkeit (die seit der Diagnose bestand) verschwunden, ihre rechtsseitige Motorik verbesserte sich und sie konnte ihre rechte Hand spontan zum Spielen benutzen und konnte ihre Finger besser strecken (Abb. 2b). Einen Monat nach der Infusion konnte sie ihre Mundsekrete kontrollieren, ohne zu sabbern, nahm größere und kräftigere Bissen zu sich, sprach mit lauterer Stimme und zeigte eine verbesserte Gesichtsmuskulatur, die ein breites Lächeln ermöglichte. Diese klinischen Verbesserungen gingen mit einer verminderten T2/FLAIR-MRT-Signalanomalie im Mittelhirn einher (Abb. 2a, c). Sechs Wochen nach der Gabe von GD2-CAR-T-Zellen hatten sich ihr Gleichgewicht, ihre Koordination und die Nutzung ihres rechten Beins verbessert, sodass sie mit ihrem rechten Bein einen Roller fahren konnte (Ergänzungstabelle 4). Mit dem Abklingen der chronischen Übelkeit verbesserte sich ihre Nahrungsaufnahme; Sie steigerte ihr Gewicht vom sechsten zum dreißigsten Perzentil und wuchs in den zwei Monaten nach der Gabe von GD2-CAR-T-Zellen um 2 Zoll an Größe.

a, MRT-Bilder (axiales T2) von Teilnehmer 3 mit DIPG (DIPG-3) zeigten 4 Wochen nach der intravenösen Infusion eine Abnahme des abnormalen T2-Signals (Tumor) in den motorischen Fasern des Kortikospinaltrakts des linken Hirnstiels (rote Pfeile), die sich weiterhin stabil verbesserte (MRT 2 Wochen nach der icv-Infusion wird ebenfalls angezeigt). b: Die rechte Hand von DIPG-3 zu Studienbeginn, die eine geringe Kraft und einen erhöhten Tonus aufwies und in chronischer Beugung gehalten wurde. Zwei Wochen nach der intravenösen Behandlung konnte eine Wiederherstellung der motorischen Funktion der rechten Hand beobachtet werden, mit gesteigerter Beweglichkeit und verbessertem Tonus. c: Veränderung des Tumorvolumens im Mittelhirn (linker Hirnstiel) im Laufe der Zeit bei DIPG-3. d: Veränderung des Tumorvolumens im Pons und Medulla sowie im mittleren Kleinhirnstiel (MCP) und im Kleinhirn im Laufe der Zeit bei DIPG-3. e: Sagittale MRT-Bilder von Patient 1 mit Rückenmarks-DMG (spinales DMG-1) zeigen eine Abnahme des Tumors (rot umrandet) nach intravenöser Behandlung (blauer Pfeil) und erneuter intravenöser Behandlung (gelber Pfeil). f, Veränderung des Rückenmarkstumorvolumens im spinalen DMG-1 im Laufe der Zeit. Die graue Schattierung zeigt den Zeitraum nach der ICV-Infusion an (c,d,f). g: Trotz einer signifikanten Tumorreduktion in f reagierte ein Temporallappentumor (roter Pfeil) im spinalen DMG-1 nicht (axiale T2-MRT-Bilder). h, die GD2-Expression im resezierten Temporallappentumor aus spinalem DMG-1 war laut Durchflusszytometrie im Vergleich zu einer Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrolle hoch und gleichmäßig.

Quelldaten

Sie wurde erneut mit 12,9 × 106 GD2-CAR-T-Zellen icv (entspricht 1 × 106 pro kg) ohne Lymphodepletion 3 Monate nach ihrer intravenösen Infusion behandelt, als die Verbesserung ihrer klinischen Untersuchung ein Plateau erreicht hatte und eine erhöhte Erkrankung des Kleinhirnstiels erkennbar war (Abb . 2d, Erweiterte Daten Abb. 2c). Sie hatte nur leichte Kopfschmerzen. Es wurden keine Antizytokinmittel oder Steroide verwendet. Ihre klinische Reaktion war gemischt. Sie zeigte innerhalb einer Woche nach ihrer zweiten GD2-CAR-T-Zell-Infusion eine zusätzliche Verbesserung der rechtsseitigen motorischen Funktion (verbesserte Dorsalflexion und Handgelenksstreckung des rechten Knöchels und weiter verstärkte Nutzung der rechten Hand) (Ergänzungstabelle 4). Im Gegensatz dazu verschlechterte sich ihre linksseitige Ataxie zunehmend, was mit einer zunehmenden Erkrankung des linken Kleinhirnstiels einherging (Abb. 2d, erweiterte Daten, Abb. 2c).

Nach dem Datenschnitt vom März 2021 erhielt diese Teilnehmerin eine weitere icv-Infusion, ihr Tumor schritt jedoch weiter fort. Sie starb 20 Monate nach der Diagnose, 4 Monate nach Beginn der Tumorprogression und 7 Monate nach ihrer ersten GD2-CAR-T-Zell-Infusion an der Tumorprogression.

Bei Patientin 1 mit spinaler DMG handelte es sich um eine 25-jährige Frau mit einer H3K27M+-DMG des Rückenmarks mit Schwerpunkt auf Brusthöhe T10–T12, die zum Zeitpunkt der Aufnahme erste Anzeichen einer klinischen und radiologischen Progression aufwies. Nach der Aufnahme in die Studie und während der Zellherstellung erlebte sie ein schnelles Fortschreiten des Tumors, was zu einer nahezu vollständigen Paraparese, starken neuropathischen Schmerzen, einem Sinnesverlust unterhalb des T10-Werts, einer Blasenfunktionsstörung, die eine Harnkatheterisierung erforderte, und einer Ausbreitung des Tumors auf ihren Schläfenlappen führte. Eine dringende Duraplastik wurde durchgeführt, um den Druck im Wirbelkanal aufgrund des sich schnell ausdehnenden, tumorinfiltrierten Rückenmarks zu verringern und ihre starken neuropathischen Schmerzen zu lindern. Die Schmerzen besserten sich nach der Duraplastik mäßig, sie benötigte jedoch weiterhin einen Lidocain-Tropf und Opiate zur Schmerzbehandlung. Sie erfüllte die Kriterien für eine GD2-CAR-T-Zell-Infusion während der Studie nicht mehr, da der Tumor vor der GD2-CAR-T-Zell-Infusion schnell fortschritt, sich neurologische verschlechterte und Kortikosteroide einnahm, und wurde aus dem Protokoll gestrichen. Sie erhielt GD2-CAR-T-Zellen (1 × 106 pro kg), die iv über ein eIND verabreicht wurden. Ab Tag +6 zeigte sie CRS Grad 3 (Fieber bis 39,6 °C und Hypotonie, die eine Unterstützung durch Vasopressoren erforderte), das 3 Tage lang mit Tocilizumab und Kortikosteroiden behandelt wurde (Tage +8–11; Ergänzungstabelle 3). Trotz des raschen Fortschreitens des Tumors vor der Behandlung mit GD2-CAR-T-Zellen zeigte die Bildgebung eine Verringerung des Volumens des Rückenmarkstumors um mehr als 90 % bis zum Tag +32 (Abb. 2e, f), begleitet von einer verbesserten Motorik und Harnfunktion der unteren Extremitäten , Auflösung neuropathischer Schmerzen und Absetzen aller Schmerzmittel 2 Monate nach der Infusion (Ergänzungstabelle 4). Im Gegensatz dazu zeigte ihre Hirnmetastasierung keine Besserung (Abb. 2g).

Sowohl die Gehirn- als auch die Rückenmarkserkrankung schritten bis zum Tag +75 voran (Abb. 2e, f). Der Tumor hatte sich weitläufig in ihrem Gehirn ausgebreitet (Extended Data Abb. 2d) und die voluminöseste Komponente im medialen Temporallappen wurde reseziert. Die Durchflusszytometrie des resezierten Gewebes zeigte eine robuste GD2-Expression der Tumorzellen (Abb. 2h), aber nur wenige infiltrierende T-Zellen. Durch qPCR wurden im resezierten Tumor des Temporallappens geringe Mengen des GD2-CAR-Transgens nachgewiesen (Abb. 1d). Da die therapeutischen Möglichkeiten begrenzt waren, wurde sie nach einer erhöhten Lymphodepletion erneut mit 50 × 106 GD2-CAR-T-Zellen behandelt, die icv verabreicht wurden, da Bedenken hinsichtlich einer Immunabstoßung der CAR-T-Zellen bestanden. Die gewählte Dosis für CAR-T-Zellen lag im Bereich der Zelldosen, die in anderen Hirntumorstudien icv verabreicht wurden6,7. Sie war chronologisch die erste Patientin, die GD2-CAR-T-Zellen icv erhielt, und ihr Verlauf beeinflusste die oben beschriebene icv-Strategie. Innerhalb von 48 Stunden entwickelte sie anhaltendes Fieber (bis zu 39,9 °C) und eine Enzephalopathie Grad 3 (Immuneffektorzell-assoziierte Neurotoxizität Grad 4 (ICANS)), verbunden mit keinen MRT-Veränderungen im normalen Gehirn und diffuser Verlangsamung mit dreiphasigen Wellen im Dauerbetrieb EEG-Überwachung, im Einklang mit einer reversiblen toxischen/metabolischen/entzündlichen Enzephalopathie (Extended Data Abb. 3). Angesichts der ausgedehnten Tumorinvasion von Gehirnstrukturen, einschließlich Thalami, Hypothalamus, Mammillarkörperchen, bilateraler Insula und bilateraler Frontallappen, konnten wir nicht zwischen ICANS und TIAN als Hauptursache für ihre Enzephalopathie unterscheiden. Sie wurde mit einer entzündungshemmenden Therapie (Anakinra, Siltuximab (ein IL-6-Antagonist) und Kortikosteroiden (iv und icv)) und oralem Dasatinib behandelt, um die Aktivität von CAR-T-Zellen8 zu dämpfen (Ergänzungstabelle 3). Innerhalb von 4 Tagen verschwand die Enzephalopathie. Die Steroide wurden abgesetzt und am Tag +24 abgesetzt. Bei ihrem Wirbelsäulentumor wurde erneut eine Regression beobachtet (Reduktion um mehr als 80 % über 3 Wochen; Abb. 2e, f) sowie bei ausgewählten Bereichen ihrer Gehirnerkrankung (Erweiterte Daten, Abb. 2d). Eine klinische Verbesserung der Rückenmarksfunktion wurde nach der zweiten Infusion nicht wie nach der ersten beobachtet (Ergänzungstabelle 4). Sowohl die Wirbelsäulen- als auch die Gehirnerkrankung schritten zwei Monate nach der icv-Infusion weiter voran und sie erhielt keine weiteren GD2-CAR-T-Zell-Infusionen. Nach dem Datenschnitt vom März 2021 überlebte sie 20 Monate ab der Diagnose, 14 Monate ab Beginn der Tumorprogression und 11 Monate nach ihrer ersten GD2-CAR-T-Zell-Infusion.

Serum- und Liquorproben wurden routinemäßig und bei klinischen Eingriffen entnommen, um Entzündungsmarker und Korrelate der Reaktion zu beurteilen. Bei Patientin 1 mit spinaler DMG wurden Liquorproben nur nach icv-Verabreichung, nicht jedoch nach iv-Verabreichung entnommen, und von Patientin 3 mit DIPG wurden aufgrund ihres jungen Alters nur begrenzte Liquorproben entnommen.

Im Zusammenhang mit der Tumorreaktion stiegen die Serumspiegel der Laktatdehydrogenase bei allen Patienten nach der Behandlung mit GD2-CAR-T-Zellen an und wurden anhand von Anzeichen einer Entzündung verfolgt (Erweiterte Daten, Abb. 4a). Mittels digitaler Tröpfchen-PCR für die tumorspezifische H3K27M-Mutation wurde bei zwei von vier Patienten zellfreie Tumor-DNA im Liquor nachgewiesen (Extended Data Abb. 4b–f). Die zellfreie Tumor-DNA im Liquor war während des Höhepunkts der Entzündung nach der icv-Behandlung erhöht, ein Muster, das bei der Abtötung von Tumorzellen zu erwarten ist9. Zusätzliche Probenahmen könnten in zukünftigen Studien die Kinetik der Abtötung von Tumorzellen weiter aufklären.

Die Expansion und Persistenz von GD2-CAR-T-Zellen wurde mithilfe von GD2-CAR-Transgen-qPCR und Durchflusszytometrie der CAR-Expression auf der Zelloberfläche überwacht. Die mittels qPCR ermittelte GD2-CAR-T-Zellexpansion im Blut ähnelte in ihrem Ausmaß der Expansion hochaktiver CAR-T-Zellen bei hämatologischen Malignomen10,11,12 (Abb. 3a). Der durchflusszytometrische Nachweis von GD2-CAR-T-Zellen im Blut war begrenzt, möglicherweise aufgrund einer verringerten Oberflächenexpression von GD2-CAR nach der Aktivierung13. GD2-CAR-T-Zellen wurden im Liquor mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen, insbesondere nach icv-Verabreichung (Abb. 3b, erweiterte Daten, Abb. 6b).

a, qPCR für GD2-CARDNA veranschaulicht die Kinetik der Expansion und Persistenz von CAR-T-Zellen im peripheren Blut nach iv- (oben) und icv- (unten) Verabreichung. Jeder Punkt stellt eine technische Nachbildung dar; n = 3 technische Replikate pro Zeitpunkt und Patient, 4 Patienten (iv), 3 Patienten (icv). b: Die Durchflusszytometrie von GD2-CAR zeigte einen signifikant höheren Anteil an CAR-T-Zellen im Liquor nach icv-GD2-CAR-T-Zell-Infusion als nach iv-Infusion zu Spitzenzeiten der Entzündung. Jeder Punkt repräsentiert einen Patienten. n = 4 Patienten (iv), 3 Patienten (icv). c, d, Proinflammatorische Zytokine im Blut und Liquor nach intravenöser Infusion (c), n = 4 Patienten und nach icv-Infusion (d), n = 3 Patienten. Beachten Sie, dass die Expression von IFNγ im Liquor von spinalem DMG-1 an Tag 1–3 nach der icv-Infusion über der oberen Nachweisgrenze des Tests lag. e, Spiegel der immunsuppressiven Zytokine TGFβ1, TGFβ2 und TGFβ3 im Liquor nach iv-Infusion. n = 3 Patienten. Heatmaps in c–e wurden aus der Luminex-Multiplex-Zytokinanalyse von Patientenblutplasma und Liquor in technischen Duplikaten erstellt. Die durchschnittlichen pg ml-1-Ergebnisse werden durch die log2-fache Änderung vom D0-Zeitpunkt dargestellt.

Quelldaten

Im Blut waren die an CRS beteiligten Zytokine, einschließlich IL-6, nach iv-Verabreichung höher als nach icv-Verabreichung, was mit dem höhergradigen CRS übereinstimmt, das nach iv-Verabreichung beobachtet wurde. Im Liquor waren die Spiegel proinflammatorischer Zytokine, einschließlich IFNγ, TNF, IL-2 und IL-6, nach icv-Verabreichung höher als nach iv-Verabreichung (Abb. 3c, d, Extended Data Abb. 5a – c). Patientin 1 mit DIPG wies erhöhte Werte an immunsuppressiven Zytokinen, einschließlich TGFβ, im Liquor (Abb. 4e, Erweiterte Daten, Abb. 5d) und prominente myeloische Populationen im Tumorgewebe (Erweiterte Daten, Abb. 1f, g) auf, was möglicherweise mit ihr korreliert Fehlen einer Rückmeldung. Zytokinanalysen bestätigten, dass Anakinra (modifiziertes rekombinantes IL-1RA) die Blut-Hirn-Schranke passierte, wobei nach iv-Gabe von Anakinra nachweisbare Mengen an IL-1RA sowohl im Blut als auch im Liquor gefunden wurden (Extended Data, Abb. 5e).

a: Die UMAP-Darstellung identifiziert Zellpopulationen in durchflusssortierten GD2-CAR+-T-Zellprodukten. n = 20.000 Einzelzellen (5.000 GD2-CAR+-Zellen aus jedem der 4 Patientenprodukte). b: Die UMAP-Darstellung identifiziert Zellpopulationen in Liquorproben von Patienten. Dargestellt sind Liquorzellen nach Patient (links) und Liquorzellen nach Zelltyp (rechts). n = 25.598 Einzelzellen. c, UMAP, das FOXP3+ regulatorische T (Treg)-Zellen hervorhebt (links). Treg-Zellpopulation (definiert durch CD4-, FOXP3- und CD25-Expression), identifiziert in CSF-Proben zu Spitzenzeiten der Entzündung nach iv- oder icv-Verabreichung (rechts). n = 523 Treg-Zellen wurden aus insgesamt 17.699 CSF-T-Zellen von 3 Teilnehmern nach iv- und 2 Teilnehmern nach icv-Verabreichung analysiert. Mit einem auf dem Bayesschen Modell basierenden scCODA-Framework (Single-Cell Compositional Data Analysis) betrug die logarithmische Faltungsänderung 0,6, die Einschlusswahrscheinlichkeit 0,75 und die Falscherkennungsrate weniger als 0,05. d, Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung der CSF-Probe wurde gefiltert, um myeloische Zellen zu isolieren. Das Clustering wurde nach der Datenintegration durch Harmony durchgeführt. n = 6.497 myeloische Zellen. e, Kreisdiagramme stellen myeloische Clusteranteile zu verschiedenen Zeitpunkten dar. Ein einzelner UMAP wurde mit myeloischen Zellen aus dem Liquor erstellt und dann individuell visuell dargestellt, basierend auf dem Zeitpunkt der Probe, gefärbt nach Patient. Beachten Sie die Veränderungen beim Vorhandensein myeloischer Cluster im Laufe der Zeit. f, Expressionssignatur von „immunaktivierend“, „immunsuppressiv“, „krankheitsassoziierte myeloische (DAM) Stufe 1“, „DAM Stufe 2“, „myeloid-abgeleitete Suppressorzelle (MDSC)“ und „Axontrakt-assoziierte Mikroglia“. (ATM)'-Zellzustände und zugehörige Darstellung innerhalb von Clustern basierend auf Einzelzell-Expressionswerten (Z-Wert).

Quelldaten

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung wurde an aus CSF isolierten Zellen (Extended Data Abb. 6a) sowie an durchflusssortierten GD2-CAR-positiven und GD2-CAR-negativen T-Zellen aus den hergestellten Produkten durchgeführt (Abb. 4a, b). Wir haben 65.598 Einzelzellen analysiert: 25.598 Zellen aus Liquor und 40.000 Zellen aus hergestellten Produkten. Die zelluläre Zusammensetzung des Liquor umfasste Lymphozyten, myeloische Zellen, seltene Astrozyten und B-Zellen (Abb. 4b). Wir beobachteten eine Population von Abstammungsdubletts, was die Möglichkeit einer Phagozytose von T-Zellen durch myeloische Zellen erhöht (Abb. 4b). Wir beobachteten mehr GD2-CAR-T-Zellen im Liquor zu Zeiten des Höhepunkts der Entzündung und mehr CSF-GD2-CAR-T-Zellen nach icv- oder iv-Verabreichung bei Patient 2 mit DIPG, dem einzigen Patienten, bei dem dieser Vergleich möglich war (Extended Data Abb. 6b). ). Durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung konnten wir keine GD2-CAR-T-Zellen im Liquor der Patienten 1 und 3 mit DIPG identifizieren. Der Vergleich hergestellter Zellprodukte für Patient 1 mit DIPG, der keine Reaktion zeigte, mit Patient 2 mit DIPG, der radiologische und klinische Vorteile aufwies, ergab zahlreiche transkriptionelle Unterschiede. Dazu gehörten die Aktivierungswege des Interferon- und PD1-Signals zu Beginn bei Patient 1 mit DIPG, was möglicherweise auf eine erhöhte tonische Signalübertragung im Zusammenhang mit einer verringerten GD2-CAR-T-Zellaktivität hinweist14 (Erweiterte Daten, Abb. 6c, d). Vergleiche anderer Produkte sind in den erweiterten Daten Abb. 6e, f dargestellt. Die Untersuchung aller Lymphozyten aus dem Liquor aller Teilnehmer ergab, dass sich die T-Zell-CD4:CD8-Verhältnisse im Liquor im Laufe der Zeit zwischen den Patienten unterschieden (Extended Data Abb. 7a). Im Liquor des Patienten wurde nach iv-GD2-CAR-T-Zell-Verabreichung im Vergleich zur icv-Verabreichung eine erhöhte Anzahl regulatorischer T-Zellen (Treg) gefunden (Abb. 4c, erweiterte Daten Abb. 7b).

Die Untersuchung aller myeloischen CSF-Zellen aller Patienten nach jedem Verabreichungsweg ergab sieben verschiedene Zellcluster, darunter Monozyten, Mikroglia und Makrophagen, die verschiedene funktionelle Signaturen exprimieren, sowie proliferierende myeloische Zellen (Abb. 4d, erweiterte Daten Abb. 8a, Ergänzungstabelle 5). . Wir identifizierten eine myeloische Population, die durch eine Interferonreaktion gekennzeichnet ist und hauptsächlich zu den Zeitpunkten der höchsten Entzündung nach der icv-Verabreichung auftritt (Abb. 4d, e). Dieser Cluster zeigte eine deutlich immunaktivierende Signatur (Abb. 4f, Erweiterte Daten Abb. 8b), die mit dem proinflammatorischen CSF-Zytokinprofil übereinstimmt, das nach der icv-Verabreichung beobachtet wurde (Abb. 3c, d). Im Gegensatz dazu traten bei der iv-Verabreichung und zu späteren Zeitpunkten Subpopulationen myeloischer Liquorzellen auf, die prominente Phagozytose- und Lipidstoffwechsel-Genprogramme exprimierten. Diese Zellen zeigten auch ein starkes immunsuppressives Profil, das mit den Transkriptionssignaturen von krankheitsassoziierten Mikroglia-15-, myeloischen Suppressorzellen- und Axontrakt-assoziierten Mikroglia-16-Zellzuständen übereinstimmte (Abb. 4e, f, Erweiterte Daten, Abb. 8). Ein Vergleich der CSF-Myeloidzellfraktion bei Patient 1 mit DIPG mit anderen Patienten zum Zeitpunkt des Höhepunkts der Entzündung zeigte unterschiedlich erhöhte Interleukin-, Chemokin- und Neutrophilen-Degranulationsprozesse (Extended Data Abb. 9a–c). In ähnlicher Weise ergab ein Vergleich der myeloischen Zellfraktion im Liquor bei Patient 2 mit DIPG auf dem Höhepunkt der Entzündung nach iv-Verabreichung im Vergleich zu icv-Verabreichung erhöhte myeloische Aktivierungsprozesse nach iv-Verabreichung (Erweiterte Daten, Abb. 9d).

Zusammen liefern diese korrelativen Studien weitere Beweise für die Aktivität von GD2-CAR-T-Zellen gegen H3K27M+ DIPG und Rückenmarks-DMG und beginnen, die bei Antitumorreaktionen beobachtete Heterogenität aufzuklären.

H3K27M+ DIPG und Rückenmarks-DMGs sind äußerst aggressive, allgemein tödliche Tumoren mit wenigen therapeutischen Optionen. Die durchschnittliche Lebenserwartung beträgt 10 Monate ab Diagnose und die 5-Jahres-Überlebensrate beträgt weniger als 1 %17. Die palliative Strahlentherapie ist die einzige etablierte Behandlung, und weder zytotoxische noch gezielte pharmakologische Ansätze haben bisher eine verbesserte Prognose gezeigt18. Die Implementierung einer Immuntherapie zur Behandlung von Tumoren an diesen prekären neuroanatomischen Stellen ist sowohl vielversprechend als auch gefährlich. Diese Phase-I-Studie wurde sorgfältig entwickelt, um mögliche Folgen einer entzündungsbedingten Schwellung eines bereits erweiterten Hirnstamms zu bewältigen. Die mit GD2-CAR-T-Zell-Infusionen verbundenen Toxizitäten waren mit intensiver unterstützender Pflege im stationären Bereich beherrschbar und reversibel. CRS und ICANS ähnelten denen, die bei anderen CAR-T-Zelltherapien beschrieben wurden19,20, aber die Patienten entwickelten auch Anzeichen und Symptome im Zusammenhang mit einer CAR-T-Zell-vermittelten Entzündung an Stellen mit ZNS-Erkrankung, die wir als TIAN bezeichnet haben. TIAN manifestierte sich am häufigsten als vorübergehende Verschlechterung bestehender Defizite, führte aber auch zu Episoden eines erhöhten ICP als Folge eines Hirnstammödems und eines daraus resultierenden obstruktiven Hydrozephalus, der ohne sofortige und angemessene Behandlung lebensbedrohlich gewesen wäre. Unser Toxizitätsmanagement-Algorithmus umfasste mehrere präventive Maßnahmen, die eine sichere Verabreichung dieser wirksamen Therapie ermöglichten. Da bei ZNS-Tumoren immer wirksamere CAR-T-Zell- und andere Immuntherapien eingesetzt werden, wird sich TIAN wahrscheinlich zu einer wichtigen Toxizitätsachse in der Neuroimmunonkologie entwickeln.

Bei diesen Patienten traten zwei Kategorien von TIAN auf: Die erste Kategorie von TIAN bezieht sich auf ICP und intrakranielle Platzeinschränkungen als Folge entzündungsbedingter Gewebeödeme und/oder Behinderungen des Liquorflusses. Dies kann eine dringende und/oder dringende Behandlung unter Anwendung der Prinzipien der neurokritischen Versorgung erfordern. Die zweite Kategorie von TIAN bezieht sich auf eine primäre Dysfunktion von Gehirn- oder Rückenmarksstrukturen, die von einer Entzündung betroffen sind. Sie ist typischerweise vorübergehend, manifestiert sich häufig in einer Verschlechterung bereits bestehender Symptome und kann oft konservativ behandelt werden, es sei denn, die neurologische Dysfunktion betrifft kritische Funktionen wie den Atemantrieb.

Obwohl die Patienten Symptome einer On-Tumor-Neurotoxizität entwickelten, zeigten sie keine Anzeichen oder Symptome einer On-Target-Toxizität außerhalb des Tumors. GD2 wird auf normalem Nervengewebe exprimiert, einschließlich des Gehirns und der peripheren Nerven, und die Behandlung mit dem von der US-amerikanischen Food and Drug Administration zugelassenen Anti-GD2-Antikörper Dinutuximab gegen Neuroblastome ist bei den meisten Kindern mit einer vorübergehenden schmerzhaften Neuropathie verbunden21,22. Keiner dieser vier Patienten entwickelte schmerzhafte Neuropathien oder andere klinische oder radiologische Anzeichen einer Toxizität am Ziel außerhalb des Tumors. Diese Studie ergänzt die wachsenden Beweise dafür, dass GD2 sicher mit CAR-T-Zellen angegriffen werden kann23,24,25,26 und steht im Einklang mit Beweisen, dass CAR-T-Zellen eine hohe Antigendichte für die volle Effektorfunktion benötigen10,13,27,28. Tatsächlich bestätigte das Autopsiegewebe von Patient 1 mit DIPG deutlich unterschiedliche GD2-Expressionsniveaus und T-Zell-Infiltration zwischen dem Tumor und dem unbeteiligten Gehirn.

Obwohl die hier berichteten klinischen Erfahrungen noch früh sind und die Zahl der bisher behandelten Teilnehmer gering ist, konnten drei von vier Patienten nach der iv-Gabe von GD2-CAR-T-Zellen einen radiologischen und klinischen Nutzen ziehen. Die beobachtete Verbesserung der neurologischen Funktion verdeutlicht das Ausmaß, in dem sich dieser diffus infiltrierende Tumor hauptsächlich in neuronale Schaltkreise integriert und diese stört – anstatt sie zu zerstören29, was das Potenzial einer tumorzellspezifischen Therapie für die funktionelle Wiederherstellung unterstreicht. Die icv-Verabreichung einer zweiten Dosis GD2-CAR-T-Zellen führte bei drei von drei behandelten Patienten zu zusätzlichen radiologischen und/oder klinischen Vorteilen. Im Vergleich zu iv-Infusionen waren icv-Verabreichungen mit einer geringeren systemischen Toxizität wie CRS verbunden und korrelierten mit erhöhten Spiegeln entzündungsfördernder Zytokine und verringerten immunsuppressiven Zellpopulationen im Liquor. Die hier beschriebenen vielversprechenden frühen Erfahrungen mit GD2-CAR-T-Zellen für DIPG und Rückenmarks-DMG schaffen die Grundlage für eine weitere Optimierung dieses Ansatzes für diesen historisch tödlichen ZNS-Krebs. In dieser klinischen Studie werden weiterhin Patienten mit H3K27M+ DIPG und spinalem DMG mit der GD2-CAR-T-Zelltherapie behandelt, um die optimale Dosis, Route und den optimalen Zeitplan sowie die Wirksamkeit zu bestimmen.

Diese Phase-I-Dosisskalationsstudie mit GD2-CAR-T-Zellen bei Kindern und jungen Erwachsenen mit pontiner und spinaler H3K27M+ DMG verwendet ein 3 + 3-Design mit den primären Zielen, die Machbarkeit der Herstellung, Sicherheit und Verträglichkeit zu bewerten und die maximal verträgliche Dosis zu ermitteln oder empfohlene Phase-II-Dosis. Die Beurteilung der klinischen Aktivität ist das sekundäre Ziel und die Identifizierung korrelativer Biomarker der Reaktion ist ein exploratives Ziel. Zur Aufnahme kamen Patienten in Frage, die eine pathologisch bestätigte Diagnose von H3K27M-mutiertem DIPG oder Rückenmarks-DMG hatten, die Standard-Strahlentherapie abgeschlossen hatten und keine Kortikosteroidtherapie erhielten (zusätzliche Zulassungs- und Ausschlusskriterien unten).

In präklinischen Studien zeigte ein Teil der Mäuse Hirnstammödeme als Folge einer Tumorentzündung, die aufgrund der neuroanatomischen Lage dieser Tumoren zu einem obstruktiven Hydrozephalus führte2. Wir erwarteten die Entwicklung neurologischer Symptome im Zusammenhang mit CAR-T-Zell-vermittelten Entzündungen an Stellen mit ZNS-Erkrankungen, die wir als TIAN bezeichnet haben. Um die mit TIAN verbundenen Risiken zu mindern, haben wir Patienten mit großen Thalamus- oder Kleinhirntumoren ausgeschlossen, die Platzierung eines Ommaya-Reservoirs bei Patienten mit DIPG gefordert, sowohl routinemäßige als auch symptomgesteuerte ICP-Messungen durchgeführt und einen Toxizitätsmanagementplan eingeführt, der die TIAN-Behandlung (CSF) umfasste Entfernung mittels Ommaya, hypertoner Kochsalzlösung und/oder Kortikosteroiden) und CRS-Management mit Anti-Zytokin-Wirkstoffen (Tocilizumab, ein IL-6R-Antagonist, und Anakinra, ein IL-1R-Antagonist) und Kortikosteroiden. Darüber hinaus enthielt das CAR-Konstrukt einen iCasp9-induzierbaren Selbstmordschalter, der mit Rimiducid im Falle einer lebensbedrohlichen Toxizität aktiviert werden konnte, die mit den oben diskutierten Ansätzen und Wirkstoffen nicht beherrschbar ist30.

Die klinische Studie und alle Änderungen wurden vom Institutional Review Board der Stanford University genehmigt. Ein externes Daten- und Sicherheitsüberwachungsgremium (DSMB) überprüfte das Protokoll, die Änderungen sowie alle wichtigen Patientenereignisse und -ergebnisse. Vor der Aufnahme in die klinische Studie gaben die Patienten und/oder ihre Eltern eine schriftliche, informierte Einwilligung ab, und gegebenenfalls wurde eine geringfügige Einwilligung eingeholt. Darüber hinaus erteilten Patienten und/oder ihre Eltern eine schriftliche, informierte Einwilligung zur Verwendung von Fotos und Videos, die in wissenschaftlichen Präsentationen und Veröffentlichungen in gedruckter und elektronischer Form verwendet werden dürfen.

Autologe mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) wurden mittels Apherese gesammelt und GD2-CAR-T-Zellen wurden unter Verwendung des geschlossenen Systems CliniMACs Prodigy (Miltenyi) hergestellt. Kurz gesagt, CD4- und CD8-T-Zellen wurden ausgewählt und mit einem bicistronischen retroviralen Vektor transduziert, der eine iCasp9-Domäne (Bellicum Pharmaceuticals, Inc.) kodiert, und einem GD2–4-1BB–CD3Ζ CAR (Abb. 1a), das das 14g2a scFv unter Kontrolle enthält eines MSCV-Promotors. GD2-CAR-T-Zellen wurden 7 Tage lang in Gegenwart von rekombinantem humanem IL-7 und IL-15 expandiert, plus der Zugabe des Tyrosinkinase-Inhibitors Dasatinib an den Tagen 3 und 5, um die T-Zell-Fitness zu verbessern31.

Es wurde eine lymphodepletierende Chemotherapie (Cyclophosphamid 500 mg m2 täglich und Fludarabin 25 mg m2 täglich an den Tagen –4, –3 und –2) verabreicht, gefolgt von einer iv CAR-T-Zell-Infusion am Tag 0 (Abb. 1b). Die Patienten wurden im stationären Bereich engmaschig überwacht, einschließlich routinemäßiger ICP-Messungen, um die Toxizität zu klären. Bei Patienten, die zweite Infusionen erhielten, wurden CAR-T-Zellen icv über das Ommaya infundiert. Der erste Patient, der mit icv verabreichten CAR-T-Zellen behandelt wurde (Patient 1 mit spinaler DMG), erhielt eine Pauschaldosis von 50 Millionen CAR-T-Zellen nach erhöhter lymphodepletierender Chemotherapie (Cyclophosphamid 600 mg m2 täglich und Fludarabin 30 mg m2 täglich an den Tagen −5, −4, −3 und −2) im Rahmen eines Einzelpatienten-eIND (siehe unten); Nachfolgende Patienten erhielten 30 Millionen CAR-T-Zellen oder das Äquivalent ihrer gewichtsbasierten Dosis bei DL1, je nachdem, welcher Wert niedriger war, icv ohne Lymphodepletion.

Krankheitsstatus

Dosissteigerungsphase und DIPG-Expansionskohorte: Gewebediagnose von H3K27M-mutiertem DIPG mit radiologisch erkennbarem Tumor, der auf den Hirnstamm beschränkt ist, oder

Dosissteigerungsphase und spinale DMG-Expansionskohorte: Gewebediagnose von H3K27M-mutiertem DMG des Rückenmarks.

Alter: größer oder gleich 2 Jahre und kleiner oder gleich 30 Jahre.

Bisherige Therapie:

Mindestens 4 Wochen nach Abschluss der Erstlinien-Strahlentherapie.

Mindestens 3 Wochen nach der Chemotherapie oder fünf Halbwertszeiten, je nachdem, welcher Wert kürzer ist, müssen seit jeder vorherigen systemischen Therapie vergangen sein, mit Ausnahme der systemischen inhibitorischen/stimulatorischen Immun-Checkpoint-Therapie, die 3 Monate erfordert.

Leistungsstatus: Teilnehmer über 16 Jahre, Karnofsky ≥ 60 % oder Leistungsstatus der Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) von 0 oder 1; Teilnehmer 16 Jahre oder jünger, Lansky-Skala ≥ 60 %. Teilnehmer, die aufgrund einer Lähmung nicht gehen können, aber im Rollstuhl sitzen, gelten für die Beurteilung der Leistungsbewertung als gehfähig.

Normale Organ- und Knochenmarksfunktion (unterstützende Pflege ist gemäß den institutionellen Standards zulässig, d. h. Filgrastim, Transfusion):

Absolute Neutrophilenzahl (ANC) ≥ 1.000 pro µl

Thrombozytenzahl ≥ 100.000 pro µl

Absolute Lymphozytenzahl ≥ 150 pro µl

Hämoglobin ≥ 8 g dl−1

Angemessene Nieren-, Leber-, Lungen- und Herzfunktion, definiert als:

Kreatinin innerhalb der institutionellen Altersnormen, d. h. ≤2 mg dl−1 bei Erwachsenen oder gemäß der folgenden Tabelle bei Kindern unter 18 Jahren) oder Kreatinin-Clearance (geschätzt nach der Cockcroft-Gault-Gleichung) ≥60 ml/min

Serum-Alanin-Transaminase/Aspartat-Transaminase (ALT/AST) ≤ 3,0 Obergrenze des Normalwerts (ULN; Grad 1)

Gesamtbilirubin ≤ 1,5 mg dl−1, außer bei Teilnehmern mit Gilbert-Syndrom

Herzauswurffraktion ≥ 45 %, kein Hinweis auf einen physiologisch signifikanten Perikarderguss, bestimmt durch ein Echokardiogramm, und keine klinisch signifikanten Befunde im Elektrokardiogramm

Ausgangssauerstoffsättigung > 92 % der Raumluft

Bei Frauen im gebärfähigen Alter muss ein negativer Schwangerschaftstest im Serum oder Urin vorliegen (Frauen, die sich einer chirurgischen Sterilisation unterzogen haben, gelten nicht als im gebärfähigen Alter).

Empfängnisverhütung: Teilnehmer im gebärfähigen oder zeugungsfähigen Alter müssen bereit sein, ab dem Zeitpunkt der Aufnahme in diese Studie und für 4 Monate nach Erhalt der präparativen Lymphodepletionskur oder solange GD2-CAR-T-Zellen im peripheren Blut nachweisbar sind, Empfängnisverhütung zu praktizieren oder CSF.

Fähigkeit zur Einwilligung nach Aufklärung. Pädiatrische Teilnehmer werden in die altersgerechte Diskussion einbezogen und für Personen ab 7 Jahren wird gegebenenfalls eine schriftliche Zustimmung eingeholt.

Großflächiger Tumorbefall des Kleinhirnwurms oder der Kleinhirnhemisphären (Pontozerebellarstielbeteiligung ist zulässig), Thalamusläsionen, die nach Einschätzung des Prüfarztes den Teilnehmer einem inakzeptablen Risiko für einen Leistenbruch aussetzen.

Klinisch signifikante Schluckstörung, beurteilt durch klinische Beurteilung.

Aktuelle systemische Kortikosteroidtherapie.

Vorherige CAR-Therapie.

Unkontrollierte Pilz-, Bakterien-, Virus- oder andere Infektionen. Eine bereits diagnostizierte Infektion, gegen die der Patient weiterhin eine antimikrobielle Therapie erhält, ist zulässig, sofern er auf die Behandlung anspricht und klinisch stabil ist.

Anhaltende Infektion mit HIV oder Hepatitis-B-Virus (HBsAg-positiv) oder Hepatitis-C-Virus (Anti-HCV-positiv). Eine Vorgeschichte von Hepatitis B oder Hepatitis C ist zulässig, wenn die Viruslast per qPCR und/oder Nukleinsäuretest nicht nachweisbar ist.

Klinisch bedeutsame systemische Erkrankung oder medizinischer Zustand (z. B. erhebliche Herz-, Lungen-, Leber- oder andere Organfunktionsstörungen), die nach Einschätzung des Hauptprüfers wahrscheinlich die Beurteilung der Sicherheit oder Wirksamkeit des Prüfplans und seiner Anforderungen beeinträchtigen.

Nach Einschätzung des Prüfers ist es unwahrscheinlich, dass der Teilnehmer alle protokollpflichtigen Studienbesuche oder -verfahren, einschließlich Nachuntersuchungen, abschließt oder die Studienanforderungen für die Teilnahme erfüllt.

Bekannte Überempfindlichkeit oder Allergie gegenüber den in dieser Studie verwendeten Wirkstoffen und/oder Reagenzien.

Primärer Immundefekt oder Autoimmunerkrankung in der Vorgeschichte (z. B. Morbus Crohn, rheumatoide Arthritis und systemischer Lupus), die innerhalb der letzten 2 Jahre eine systemische Immunsuppression und/oder systemische krankheitsmodifizierende Arzneimittel erfordert.

Die radiologischen Reaktionen wurden durch Gadolinium-verstärkte MRT-Scans des Gehirns und/oder des Rückenmarks bewertet. Da DMGs diffus in ZNS-Strukturen eindringen und daher schwierig zu messen sind, wurde von einem Neuroradiologen (KWY) eine volumetrische Tumorsegmentierung der T2/FLAIR-Signalanomalie durchgeführt, um radiologische Veränderungen zu messen.

Das klinische Ansprechen wurde durch eine neurologische Untersuchung beurteilt. Um die klinische Veränderung zu quantifizieren, wurde ein Clinical Improvement Score (CIS) berechnet. Das CIS stellt eine ungewichtete Quantifizierung der neurologischen Untersuchung dar und wird von einem Neurologen durchgeführt, der den Teilnehmer vor der Infusion und dann zu bestimmten Zeitpunkten nach der Therapie untersucht. Für jedes neurologische Symptom oder Zeichen wird ein Punkt vergeben. Bei einer Verbesserung eines bestimmten Symptoms oder Zeichens gegenüber dem Ausgangswert vor der Infusion wird ein Punkt zur Punktzahl hinzugefügt, bei keiner Änderung wird null hinzugefügt und ein Punkt wird für eine Symptom- oder Zeichenverschlechterung abgezogen. Die gemeldete Punktzahl ist eine Summe der positiven und negativen Punkte. Beispielsweise würde ein Teilnehmer mit verbesserter Kraft der rechten oberen Extremität und verbesserter Lähmung des sechsten Nervs links eine Punktzahl von +2 erhalten. Ein Teilnehmer mit einer verbesserten Kraft der rechten oberen und unteren Extremität, einer verbesserten Lähmung des sechsten Nervs links, aber einem verschlechterten linken Gesichtsgefühl würde ebenfalls eine Punktzahl von +2 (+3 − 1 = +2) erhalten. Die Beurteilung kann nicht innerhalb von 7 Tagen nach der Verabreichung von Kortikosteroiden durchgeführt werden. Musterformulare finden Sie in den Ergänzungstabellen 6 und 7.

Zu vorab festgelegten und auslösenden Zeitpunkten während des gesamten Behandlungsverlaufs wurden Liquorproben von Patienten entnommen. Um das Zellkompartiment sanft zu trennen, wurden die Proben innerhalb einer Stunde nach der Entnahme 10 Minuten lang bei 1.800 g bei 4 °C zentrifugiert, gefolgt von 10 Minuten lang bei 20.000 g. Der Überstand wurde bei –80 °C eingefroren. Die DNA-Extraktion wurde an Aliquots von 0,5–3 ml CSF-Überstand unter Verwendung des QIAmp Circulated Nucleic Acids Kit (Qiagen) in 25 µl Extraktionspuffer durchgeführt. Alle Proben wurden mittels Nanotropfen- und Fragmentgrößenverteilung mit dem BioAnalyzer (Agilent) auf zellfreie DNA-Konzentration untersucht.

Vorwärts- und Rückwärtsprimer sowie Wildtyp- oder mutierte Sonden wurden entwickelt, um die H3F3A-K27M-Mutation durch digitale Tröpfchen-Polymerase-Kettenreaktion (ddPCR) optimal nachzuweisen, und es wurde eine Verdünnungsreihe des mutierten H3K27M-g-Blocks gegen einen Wildtyp-H3-Hintergrund durchgeführt Validieren Sie die Linearität und bestätigen Sie die Nachweisgrenze. Für jeden Zeitpunkt wurden sieben PCR-Zyklen zur Voramplifikation mit 10 µl extrahierter zellfreier DNA mit Q5 Hot Start High-Fidelity Master Mix (New England Biolabs) durchgeführt. Voramplifizierte Reaktionen wurden sofort nach der letzten Verlängerung auf Eis gelegt und mit 100 μl TE-Puffer, pH 8,0, verdünnt, um die Q5-Polymerase zu inaktivieren. Die Proben wurden sofort für die ddPCR (40 Zyklen; Bio-Rad) verwendet und als 4–6 technische Replikate getestet. Die rohen Spektraldaten wurden mit der Bio-Rad-Software analysiert, um das Signal für Mutanten- und Wildtyp-Allele darzustellen. Alle Läufe enthielten positive und negative Kontrollen. Die Ergebnisse wurden in R analysiert, um die Varianten-Allel-Häufigkeit (VAF) sowie die Mutationszahl pro Volumen über die Zeit darzustellen.

Patientenblut- und Tumorgewebeproben wurden verarbeitet und mononukleäre Zellen lebensfähig kryokonserviert. DNA wurde aus Vollblut (2 × 106–5 × 106 PBMCs) mit dem QIAmp DNA Blood Mini Kit (51306, Qiagen) zu Studienbeginn und zu mehreren Zeitpunkten nach der CAR-Verabreichung sowie aus Tumorgewebeproben mit dem DNeasy 96 Blood & Tissue Kit (69582, Qiagen). Das Vorhandensein von CAR wurde durch qPCR unter Verwendung der unten und in der Ergänzungstabelle 8 angegebenen Primer- und Sondensequenzen gemessen. Für die Standardkurve wurde ein benutzerdefiniertes Minigene-Plasmid (IDT) entworfen, das eine teilweise GD2–4-1BB–CD3Ζ-Sequenz und ein teilweises Albumin enthielt Sequenz, die als Kontrolle für die Normalisierung diente (Ergänzungstabelle 8). Die Standardkurve enthielt eine zehnfache Reihenverdünnung des Plasmids zwischen 5 × 108 und 5 × 100 Kopien. Sowohl Plasmid- als auch Patienten-DNA von jedem Zeitpunkt wurden dreifach getestet, wobei jede Reaktion 5 µl DNA (insgesamt 50 ng), 200 nM Vorwärts- und Rückwärts-Albumin-Primer (oder 300 nM Vorwärts- und Rückwärts-GD2–4-1BB–CD3Ζ-Primer) enthielt. , 150 nM Sonde, suspendiert in 10 µl TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), ohne AmpErase UNG (Thermo Fisher Scientific) und 24,5 µl (Albumin) oder 22,5 µl (GD2–4-1BB–CD3Ζ) TE-Puffer (AM9935). , Invitrogen). Für die qPCR wurde das Thermo Fisher Scientific QuantStudio 6 Pro Echtzeit-qPCR-Instrument mit 20 µl pro Reaktion verwendet. Die Qualitätsmetriken für alle qPCR-Standardkurvenergebnisse waren R2 > 0,95 und die Effizienz betrug 70–110 %.

Albumin ergibt sich aus einer auf durchschnittliches Albumin normalisierten Platte, dann wird die GD2-CAR-Kopienzahl (Kopien pro 50 ng DNA) an Albumin angepasst und durch die folgende Gleichung auf Kopien pro 100 ng DNA modifiziert: Kopienzahl (Kopien pro 100 ng DNA) = 2 × (GD2-CAR-Kopienzahl × (Albumin-Kopienzahl/durchschnittliches Albumin)). Zu den qPCR-Reagenzien gehörten eine Albuminsonde (5'-/56-FAM/CCTGTCATG/ZEN/CCCACACAAAATCTCTCC/3IABkFQ/-3'), ein Albumin-Vorwärtsprimer (5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3') und ein Albumin-Rückwärtsprimer (5'-ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3). '), GD2-CAR FAM-Sonde (5'-/56-FAM/TCATGTTGT/ZEN/AGCCGGTGA AGGAGC/3IABkFQ/-3'), GD2-CAR Vorwärtsprimer (5'-CTTCTGTGATGATCTCCTGCAA-3'), GD2-CAR Rückwärts Primer (5'-CGATCCATTCCAGGCTCTT-3') und GD2-Albumin-Minigen-Plasmid (enthält keine proprietäre Rückgratsequenz; 5'-GCTGGCCTTTTGCTCACAAGCTTGGGGTTGCTGTCATCTCTTGTGGGCTGTAATC ATCGTCTAGGCTTAAGAGTAATATTGCAAAACCTGTCATGCCCACACAAATCTCT CCCTGGCATTGTTGTCTTTGCAGATGTCAGTGAAAGAGAACCAGCAGCT CCCATG AGTCCCAAGCTATGTTCTTTCCTGCGTTTCTCTGGTGGAACCTGGCGCCTCTGTG ATGATCTCCTGCAAGGCCAGCGGCA GCTCCTTCACCGGCTACAACATGAACTGGG TGCGCCAGAACATCGGCAAGAGCCTGGAATGGATCGGCGCCATCGACCCCTACTACGGCGGCACCAGCT).

Für die Immunprofilierung von CAR-T-Zellen in Echtzeit wurde ein hochdimensionales (Hi-D) Immunphänotypisierungs-Durchflusszytometrie-Panel entwickelt. PBMCs wurden aus frischem Vollblut durch Gradientenzentrifugation auf Ficoll (Ficoll-Paque Plus, GE Healthcare, Sigma-Aldrich) isoliert. Zwei bis fünf Millionen PBMCs wurden mit einer fixierbaren aminreaktiven Lebensfähigkeitsfärbung in lebendem/totem Aqua (Invitrogen) gefärbt. Die Zellen wurden dann 5 Minuten lang mit Fc-Block (Trusttain, BioLegend) vorinkubiert und dann bei Raumtemperatur mit dem folgenden Fluorochrom-konjugierten mAb in einer Färbekombination mit 15 Farben und 17 Parametern angefärbt (Ergänzungstabelle 9).

CAR-transduzierte T-Zellen wurden als Positivkontrolle in den täglichen Färbeexperimenten verwendet. Gefärbte und fixierte Zellen wurden mit einem LSR-Analysegerät (BD BioSciences) mit fünf Lasern (blau 488 nm, violett 405 nm, UV-Laser 355 nm, rot 640 nm und grün 532 nm) erfasst. Es wurden mindestens 106 Zellen erworben, es sei denn, die Anzahl der aus 8 ml Vollblut isolierten Zellen oder die Gewinnung isolierter Zellen aus Liquor beschränkte die Zahl. Die Nachweisgrenze des Assays für Zellen wurde mit 1 von 104 der insgesamt erworbenen PBMCs berechnet. Ein repräsentatives Gating ist in Abb. 10a der erweiterten Daten dargestellt.

Patientenblut- und Liquorproben wurden während der gesamten Behandlung zu vorher festgelegten und auslösenden Zeitpunkten entnommen. Die Proben wurden 6 Minuten lang bei 250 g geschleudert. Der Überstand wurde bei –80 °C eingefroren, bis er zur Beurteilung abgefüllt wurde. Die Zytokinbewertung wurde vom Immunoassay Team-Human Immune Monitoring Center der Stanford University durchgeführt. Zu den Panels gehören Luminex-EMD Millipore HIMC H80 (Panel 1 ist Milliplex HCYTA-60K-PX48; Panel 2 ist Milliplex HCP2MAG-62K-PX23; Panel 3 enthält Milliplex HSP1MAG-63K-06 und HADCYMAG-61K-03 (Resistin, Leptin und). HGF) zur Erzeugung eines 9-Plexus) und TGFβ (TGFBMAG-64K-03). Die Kits wurden von EMD Millipore Corporation erworben und gemäß den Empfehlungen des Herstellers mit den beschriebenen Modifikationen verwendet. Der Assay-Aufbau folgte dem empfohlenen Protokoll. Kurz gesagt, die Proben wurden dreifach (Panel 1 und 2) oder zehnfach (Panel 3) verdünnt. Von der verdünnten Probe wurden 25 µl mit Antikörper-gebundenen Magnetkügelchen in einer 96-Well-Platte gemischt und über Nacht bei 4 °C unter Schütteln inkubiert. Inkubationsschritte bei Kälte und Raumtemperatur wurden auf einem Orbitalschüttler bei 500–600 U/min durchgeführt. Die Platten wurden zweimal mit Waschpuffer in einem Biotek ELx405-Waschgerät (BioTek Instruments) gewaschen. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur mit biotinyliertem Nachweisantikörper wurde Streptavidin-Phycoerythrin (PE) 30 Minuten lang unter Schütteln zugegeben. Die Platten wurden wie oben beschrieben gewaschen und den Vertiefungen PBS zum Ablesen im Luminex FlexMap3D-Instrument mit einer Untergrenze von 50 Perlen pro Probe und Zytokin zugesetzt. Custom Assay Chex-Kontrollkügelchen wurden gekauft und allen Vertiefungen hinzugefügt (Radix Biosolutions). Alle gesammelten Vertiefungen erfüllten die Qualitätskontrollkriterien mit einer Perlenzahl von >50. Die Daten werden in pg ml-1 basierend auf Standardkurven oder Wärmekarten der Faltungsänderung gegenüber dem Basiszeitpunkt dargestellt. Alle Proben wurden im technischen Duplikat untersucht.

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) wurde mithilfe der 5′ v2 Single Cell Immune Profiling-Technologie (10X Genomics) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, Zellen aus CSF-Proben, die zu angegebenen Zeitpunkten vor und nach der Verabreichung von CAR-T-Zellen gesammelt wurden, sowie sortierte CAR+- und CAR−-Zellen aus den CAR-T-Zell-Infusionsprodukten wurden gezählt, auf 700–1.200 Zellen pro µl resuspendiert und eingefangen Verwendung von Single Cell Chip A auf dem 10x Chromium Controller (10X Genomics) zur Erzeugung von Gel-Bead-in-Emulsionen (GEMs). Die umgekehrte Transkription innerhalb von GEMs wurde mit einem C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad) durchgeführt. Komplementäre DNA (cDNA) mit Barcode wurde durch Post-GEM-RT-Reinigung und PCR-Amplifikation gewonnen. Die gewonnene cDNA wurde amplifiziert und zum Aufbau von 5′-Gesamttranskriptombibliotheken verwendet. Die Qualität der cDNA und jeder Bibliothek wurde mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer bewertet. Die Bibliotheken wurden mit einem Chromium i7 Sample Index Kit indiziert, gepoolt und auf dem NovaSeq 6000 System (Illumina) von Novogene sequenziert.

Rohsequenzierungsdaten wurden mit der Cell Ranger-Softwareversion 6.0.0 oder höher (10X Genomics) verarbeitet. Die Base-Call-Dateien (BCLs) von Sequencer wurden mithilfe der Cellranger-Mkfastq-Pipeline in FASTQ-Dateien demultiplext. Um die CAR-Sequenzerkennung in den scRNA-seq-Daten zu optimieren, haben wir die FASTQ-Dateien mit SeqKit32 in 50-Basenpaar-Segmenten der GD2-CAR-Plasmidsequenz untersucht. Nachdem wir die Segmente mit den meisten Treffern identifiziert hatten, erstellten wir eine benutzerdefinierte Referenz, indem wir diese Segmente mit der Cellranger-Mkref-Pipeline an die Referenz des menschlichen Genoms GRCh38 5.0.0 anhängten. FASTQ-Dateien wurden mithilfe der Cellranger-Count-Pipeline an dieser benutzerdefinierten Referenz ausgerichtet.

UMI-Zählmatrizen (Unique Molecular Identifier) ​​von Cell Ranger wurden mit Seurat33 analysiert. Abgestorbene Zellen und Zelltrümmer, bei denen mehr als 15 % der UMI-Zählungen mitochondrialen Genen zugeordnet waren oder bei denen weniger als 300 Gene nachgewiesen wurden, wurden von der Analyse ausgeschlossen. Zelldubletts mit mehr als 10.000 Genen oder mehr als 50.000 UMI-Zählungen wurden ebenfalls ausgeschlossen. Als nächstes wurden die scRNA-seq-Daten auf 5.000 Zellen pro Probe unterabgetastet und alle Daten wurden zusammen mit der SCTransform-Pipeline34 auf die Sequenzierungstiefe normalisiert. Daten zwischen Patienten wurden mithilfe der reziproken Hauptkomponentenanalyse (RPCA) integriert. PCA wurde unter Verwendung aller variablen Gene mit Ausnahme der TCR- und BCR-Gene durchgeführt, um zu verhindern, dass Klonotypen das endgültige Layout beeinflussen. Darüber hinaus wurde eine Reihe kuratierter Gene, die für die T-Zell-Funktion oder die Identifizierung des Zelltyps relevant sind, in die Liste der variablen Gene aufgenommen. Die UMAP-Einbettung wurde mit den ersten 50 Hauptkomponenten durchgeführt. Zelltypen wurden allen Zellen basierend auf der kanonischen Abstammungsmarker-Expression zugeordnet. Zelltyp-Dubletts („Abstammungs-Dubletts“) wurden als Zellen identifiziert, die Marker von mehr als einer Abstammungslinie exprimieren: T-Zellen (CD2, CD3E, CD3D, CD3G, CD247, CD7 und GD2-CAR), B-Zellen (CD19, CD22 und PAX5). ), Mikroglia/myeloische Zellen (CD14, CD68, CD163, CSF1R und AIF1) oder Astrozyten (GFAP). Die Analyse der differentiellen Expression wurde an SCT-Zählungen durchgeführt, die mithilfe der FindMarkers-Pipeline als negative Binomialverteilung modelliert wurden.

Eine weitere Analyse von Patient 1 mit DIPG und anderen CSF-Proben der Teilnehmer wurde unter Verwendung des R-basierten „Seurat“-Pakets35 durchgeführt, um Transkriptionsunterschiede vor und während der Verabreichung von CAR-T-Zellen zu bewerten. Zunächst wurde das große Seurat-Objekt in verschiedene kleinere Objekte unterteilt, um mehrere Vergleiche zwischen verschiedenen DIPG-CSF-Proben zu ermöglichen (siehe Abb. 4). Anschließend wurden Seurat-Objekte einer Skalierung und Dimensionsreduktion basierend auf dem UMAP-Algorithmus unterzogen36. Myeloidfraktionen des Datensatzes wurden mithilfe der Funktion „AddModuleScore“ in Seurat identifiziert, um Zellen mit relativ hoher Expression myeloider Gene (AIF1, CSF1R, CX3CR1, CD14, CD68 und CD163) im Vergleich zu ihrer Expression von B-Zell-verwandten Genen (CD19) zu isolieren , CD22 und PAX5) und T-Zell-bezogene (CD2, CD3E, CD3D, CD3G, CD247 und CD7) Gene. Die Bewertung von Zellen basierend auf der Genexpression von krankheitsassoziierten myeloischen (DAM) oder myeloiden Suppressorzellen (MDSC) wurde mithilfe der Funktionen „AddModuleScore“ und „FeaturePlot“ in Seurat implementiert. Zu den DAM-Genen gehörten SPP1, GPNMB, IGF1, CLEC7A, LPL, CD9, CD63, LGALS3, FABP5, ITGAX, APOE und TYROBP, basierend auf früheren bemerkenswerten Charakterisierungen myeloischer Zellen bei Krankheiten15,16,37,38. Zu den MDSC-Genen gehörten CD33, CD14, CD15 und IL4RA39. Die Vulkanplotanalyse wurde mit dem R-basierten Paket „EnhancedVolcano“40 durchgeführt. Die Analyse der Genontologie (GO) wurde mit dem R-basierten „ReactomePA“-Paket41 durchgeführt.

Die Einzelzell-Expressionswerte wurden auf ähnliche Weise wie zuvor beschrieben berechnet42. Bei einem gegebenen Satz von Genen (Gj) für einen Gensatz (z. B. einer DAM-Signatur) wurde ein Score, SCj(i), berechnet, der den skalierten Ausdruck (Z-Score) von Gj für jede Zelle i quantifiziert durchschnittliche skalierte Expression (Er) der Gene in Gj, verglichen mit der durchschnittlichen skalierten Expression eines Kontrollgensatzes Gcont: SC (i) = Durchschnitt[Er(G, i)] − Durchschnitt[Er(Gcont, i)]. Für jedes Gen des Gensatzes enthält der Kontrollgensatz 100 Gene mit dem aggregierten Expressionsniveau, das diesem Gen am ähnlichsten ist. Daher stellt der Kontrollgensatz eine 100-fach größere, aber vergleichbare Verteilung der Expressionsniveaus dar wie der betrachtete Gensatz.

Graphbasiertes Clustering mit Datenintegration wurde angepasst, um zelluläre Cluster zu identifizieren. Wir haben hochvariable Gene (HVGs) mithilfe der FindVariableFeatures-Funktion in Seurat ausgewählt und die skalierten Expressionswerte dieser HVGs für PCA verwendet. Um probenspezifische biologische Variationen von zellsubpopulationsspezifischen Variationen zu trennen und mehrere Proben zu integrieren, haben wir eine lineare Anpassungsmethode namens Harmony auf die ersten 30 Hauptkomponenten mit Standardparametern angewendet, um eine korrigierte Einbettung zu erzeugen43. Wir haben die ersten 20 Harmony-korrigierten Dimensionen für die Konstruktion von UMAP-Einbettungen durch RunUMAP in Seurat und geclusterten Zellen durch den auf dem Louvain-Algorithmus basierenden FindClusters in Seurat ausgewählt. Zellen, die aus unterschiedlichen Proben stammten, aber ähnliche Genprogramme exprimierten, waren gut gemischt. Als nächstes identifizierten wir mithilfe von FindAllMarkers in Seurat differentiell exprimierte Gene (DEGs) und testeten Gene, die in mindestens 30 % der Zellen innerhalb jedes Clusters nachgewiesen wurden und die mindestens einen 0,5-fachen mittleren logarithmischen Unterschied aufwiesen. Wir verwendeten den Wilcoxon-Rangsummentest mit Bonferroni-Korrektur für mehrere Tests und behielten nur Gene mit angepasstem P <0,05 bei. Zellcluster wurden durch manuelle Überprüfung ihrer Top-DEGs mit Anmerkungen versehen. Darüber hinaus testeten wir die Anreicherung der beschriebenen Gensätze (biologische GO-Prozesse) und verglichen die Expressionsprogramme jedes Zellclusters mit denen eines veröffentlichten Glioblastom-assoziierten myeloischen Zelldatensatzes44.

Die Immunhistochemie (außer für GD2 und H3K27M) wurde an formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten gemäß Standardprotokollen durchgeführt, einschließlich Entparaffinierung, Antigengewinnung, Inkubation mit primärem Antikörper und Nachweis gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die folgenden Antikörper wurden verwendet: CD3 (790–4341, Ventana; Kaninchen polyklonal, vorverdünnt), CD4 (NCL-CD4-368, Leica (Novocastra); Maus monoklonal, 1:40 Verdünnung), CD8 (M7103, Dako; monoklonale Maus , 1:400 Verdünnung) und CD163 (760–4437, Ventana; monoklonale Maus, vorverdünnt). Die Färbungen für CD3 und CD163 wurden auf einem automatisierten Färbegerät Ventana BenchMark Ultra unter Verwendung von CC1-Antigen-Retrieval durchgeführt. Die Färbungen für CD4 und CD8 wurden auf einem automatischen Färbegerät von Leica Bond unter Verwendung der ER2-Antigen-Abfrage durchgeführt.

Für die H3K27M- und GD2-Immunhistochemie wurden Primärtumorproben von Patienten in Kryoformen überführt und in eine Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) (TissueTek) eingebettet. Kryoschnitte (10 µm) wurden auf einem Kryostat (Leica) erstellt. Das Gewebe wurde mit 4 % PFA bei 4 °C für 20 Minuten fixiert, dann gewaschen und die endogene Peroxidaseaktivität wurde vor der Permeabilisierung (0,3 % Triton X-100, TBS, 15 Minuten bei Raumtemperatur) neutralisiert (Bloxall, Vector Laboratories; 10 Minuten bei Raumtemperatur). Temperatur) und Blockierung (5 % Pferdeserum, Vector Laboratories; 20 min bei Raumtemperatur). Für H3K27M (ab190631, Abcam; 1:1.000, 1 h bei Raumtemperatur) und GD2 (14g2a, BD; 1:500, 1 h bei Raumtemperatur) wurde eine sequentielle Doppelfärbungs-Immunhistochemie durchgeführt. H3K27M wurde mit einer sekundären Peroxidase (ImmPRESS VR Anti-Kaninchen-IgG, Vector Laboratories; 30 Minuten bei Raumtemperatur) und einem DAB-Substrat (BD) entwickelt. Nach Abschrecken der DAB-Substratentwicklung in TBS und Anfärben mit dem 14g2a-Primärantikörper wurde das GD2-Signal unter Verwendung eines polymerbasierten alkalischen Phosphatase-Sekundärantikörpers (ImmPRESS AP Anti-Maus-IgG, Vector Laboratories; 30 Minuten bei Raumtemperatur) und blauer alkalischer Substanz entwickelt Phosphatase-Substrat (Vector Blue AP-Substrat-Kit, Vector Laboratories; 5 Min. bei Raumtemperatur). Die Entwicklung der alkalischen Phosphatase wurde in TBS gestoppt und die Proben wurden montiert und durch Lichtmikroskopie (Zeiss Axio Imager M2) abgebildet.

Für die Immunfluoreszenz wurden Primärtumorproben von Patienten über Nacht in 4 % PFA fixiert und dann in 30 % Saccharose überführt, bis die Proben sanken (3–4 Tage). Auf einem automatischen Gefriermikrotom (HM450, Thermo Fisher) wurden serielle 40-µm-Kryoschnitte erstellt und dann mit 3 % normalem Eselserum in 0,3 % Triton X-100 in TBS-Blockierungslösung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Schnitte wurden über Nacht bei 4 °C in Primärantikörper gefärbt. Die verwendeten Antikörper waren Maus-Anti-H3K27M (ab190631, Abcam; 1:1000) und Kaninchen-Anti-IBA1 (019–19741, Wako; 1:500), verdünnt in 1 % normalem Eselserum in 0,3 % Triton X-100 in TBS-Blockierungslösung . Die Schnitte wurden in sekundärem Antikörper, der entweder mit 594 oder 488 konjugiert war, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert (715-585-150 und 711-545-152, Jackson Immunoresearch; 1:500). Die Proben wurden mit ProLong Gold-Eindeckmedium (P36930, Life Technologies) montiert und mittels konfokaler Mikroskopie (LSM710, Zeiss) abgebildet. Für die RNAscope-In-situ-Hybridisierung zur Visualisierung des GD2-CAR-Konstrukts wurden Primärtumorproben von Patienten in Kryoformen übertragen und in eine Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) (TissueTek) eingebettet. 10-µm-Kryoschnitte wurden auf einem Kryostat (Leica) erstellt. Die Objektträger wurden mit kalter 4 %iger PFA 15 Minuten lang bei 4 °C fixiert und dann in zunehmenden Ethanolspülungen dehydriert. Zur Vorbereitung der Färbung wurde das Gewebe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit RNAscope-Wasserstoffperoxid vorbehandelt, dann mit RNAscope-Protease IV behandelt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert (ACD 322381). Anschließend wurde das Gewebe gemäß dem Kit-Protokoll für den RNAscope 2.5 HD Duplex Assay (ACD, 322500) gefärbt. Um Kontrollzellen für GD2-CAR RNAscope zu färben, wurden GD2-CAR-T-Zellen aus gefrorenem Zustand aufgetaut und für die Färbung gemäß dem RNAscope Multiplex v2 Assay (ACD-Dokument MK-50 010) vorbereitet. Kurz gesagt, die Zellen wurden 24 Stunden lang in Wachstumsmedium auf Kammerobjektträgern ausgesät und dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % PFA fixiert. Anschließend wurden die Zellen mit Ethanal dehydriert und bis zur Färbung in 100 % Ethanol bei –20 °C gelagert. Am Tag der Färbung wurden die Zellen mit Ethanolspülungen rehydriert und dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit RNAscope-Wasserstoffperoxid vorbehandelt, gefolgt von 1:15 mit PBS verdünnter RNAscope-Protease III 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (ACD 322381) und dann parallel gefärbt die Gewebeproben. Eine benutzerdefinierte Sonde wurde entwickelt, um das GD2-CAR-Konstrukt unter Verwendung der folgenden Sequenz anzuvisieren:. Nach der Sondenhybridisierung, Amplifikation und Detektion gemäß Kit-Handbuch wurden die Objektträger 30 Sekunden lang mit 50 % Hämatoxylin gegengefärbt, gefolgt von 0,02 % Ammoniakwasser zur Blaufärbung. Die Objektträger wurden 15 Minuten lang bei 60 °C getrocknet, dann montiert und durch Lichtmikroskopie (Zeiss Axio Imager M2) abgebildet.

Das Tumorresektionsmaterial wurde wie zuvor beschrieben in Einzelzellsuspensionen verdaut45. Einzelzellsuspensionen wurden mit den folgenden Antikörpern angefärbt (Ergänzungstabelle 10) und das Gating wurde unter Verwendung von Fluoreszenz minus einer Kontrolle (FMO) auf einem BD LSRFortessa durchgeführt. DIPG-Zellen wurden kontrolliert, um die GD2-Expression in der CD45−, B7-H3+-Population zu bewerten. Die Gating-Strategie ist in Extended Data Abb. 10b dargestellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verlinkt ist.

Alle Rohdaten werden in den Quelldatendateien bereitgestellt. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten wurden auf den Gene Expression Omnibus (GSE186802) hochgeladen. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir sind unseren mutigen Patienten und ihren Familien dankbar; A. Quinones-Hinojosa, K. Jaeckle, H. Tran, D. Poon, M. Casazza, D. Brown, S. Herrera, R. Taiwo, R. Jamiolkowski, A. Wu, S. Vaca, D. Herrick, D. Purger, D. Hong, A. Cluster, D. Limbrick, E. Mayne, C. Tesi-Rocha, C. Wusthoff, S. Lee, F. Baumer, J. Klotz, T. Nguyen und viele andere auf dem klinische Teams für die Zusammenarbeit bei der Betreuung dieser Patienten; J. Senesac und Bellicum für die Bereitstellung studienrelevanter Materialien in Form des viralen Vektors und des AP1903-Angebots; JS Tamaresis für statistische Unterstützung beim Studiendesign; Y. Pan für Hilfe bei der Formatierung von Abbildungen; S. Marsh und B. Stevens für Beiträge zu Transkriptionssignaturen myeloischer Zellen; N. Lepori-Bui, T. Tutt und A.-L. Gramstrup Petersen für ihr Fachwissen in der Zellformulierung; und der Stanford Human Immune Monitoring Core (HIMC) zur Durchführung von Zytokin-Assays. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health R01 CA263500-01 (CLM und MM), dem Parker Institute for Cancer Immunotherapy (CLM und RGM), CureSearch (CLM, MM und RGM), einer St. Baldrick's Foundation – Stand Up 2, unterstützt Translationales Forschungsstipendium des Cancer Pediatric Cancer Dream Team (SU2CAACR-DT1113; CLM, RGM, SR und MM), Stella S. Jones Foundation (MM), The V Foundation (RGM), NIH Director's Pioneer Award (DP1NS111132; MM), NIH Director's New Innovator Award (DP2-CA272092; RGM), ChadTough Defeat DIPG (J. Mahdi), Waxman Family Research Fund (ACG) und Virginia and DK Ludwig Fund for Cancer Research (CLM und MM). Die St. Baldrick's Foundation arbeitet mit Stand Up 2 Cancer zusammen, einem Programm der Entertainment Industry Foundation, das von der American Association for Cancer Research verwaltet wird.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Robbie G. Majzner, Sneha Ramakrishna

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Crystal L. Mackall, Michelle Monje

Stanford Center for Cancer Cell Therapy, Stanford Cancer Institute, Stanford University, Stanford, CA, USA

Robbie G. Majzner, Sneha Ramakrishna, Shabnum Patel, Harshini Chinnasamy, Liora M. Schultz, Rebecca M. Richards, Valentin Barsan, Zinaida Good, Agnes Reschke, Christina Baggott, Sharon Mavroukakis, Emily Egeler, Jennifer Moon, Courtney Erickson, Michael Kunicki , Michelle Fujimoto, Snehit Prabhu, Bita Sahaf, Kara L. Davis, Steven A. Feldman, Crystal L. Mackall und Michelle Monje

Abteilung für pädiatrische Hämatologie, Onkologie, Stammzelltransplantation und regenerative Medizin, Abteilung für Pädiatrie, Stanford University, Stanford, CA, USA

Robbie G. Majzner, Sneha Ramakrishna, Liora M. Schultz, Rebecca M. Richards, Valentine Barsan, Agnes Reschke, Maria Caterina Rotiroti, Sean Green, Michael Kunicki, Michelle Fujimoto, Zach Ehlinger, Warren Reynolds, Sreevidya Kurra, Bita Sahaf, Kara L. Davis, Crystal L. Mackall und Michelle Monk

Parker Institute for Cancer Immunotherapy, San Francisco, CA, USA

Robbie G. Majzner, Zinaida Good und Crystal L. Mackall

Abteilung für Neuroradiologie, Abteilung für Radiologie, Stanford University, Stanford, CA, USA

Kristen W. Yeom

Abteilung für pädiatrische Neuroonkologie, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA

Li Jiang, Katherine E. Warren und Mariella G. Philbin

Abteilung für Neurologie und neurologische Wissenschaften, Stanford University, Stanford, CA, USA

Rebecca Mancusi, Anna C. Geraghty, Aaron Y. Mochizuki, Shawn M. Gillespie, Jasia Mahdi, Esther H. Nie, Isabelle J. Chau, Christopher W. Mount, Sonia Partap, Paul G. Fisher, Cynthia J. Campen und Michelle Monje

Abteilung für biomedizinische Datenwissenschaft, Stanford University, Stanford, CA, USA

Zinaida Gut

Abteilung für Pathologie, Stanford University, Stanford, CA, USA

Angus Martin Shaw Toland, Hannes Vogel und Michelle Monk

Abteilung für Intensivmedizin, Abteilung für Pädiatrie, Stanford University, Stanford, CA, USA

Lindsey Rasmussen und Timothy T. Cornell

Abteilung für Neurochirurgie, Stanford University, Stanford, CA, USA

Gerald Grant und Michelle Monje

Abteilung für Stammzelltransplantation und Zelltherapie, Medizinische Fakultät, Stanford University, Stanford, CA, USA

Crystal L. Mackall

Howard Hughes Medical Institute, Stanford University, Stanford, CA, USA

Michelle Monje

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MM ist der Hauptermittler des Prozesses. CLM ist Inhaber des Investigational New Drug (IND). CWM, RGM, CLM und MM konzipierten das Projekt. SM, EE und CB überwachten die Regulierungsangelegenheiten. SM, EE, MM, CLM, CWM, RGM, S. Partap, CJC, LR, TTC, KEW und GG planten, gestalteten und/oder schrieben die klinische Studie, Änderungen und Behandlungsprotokolle. KEW und MM haben die klinische Verbesserungsskala entworfen. S. Patel, HC und SAF führten die Prozessentwicklung für die Zellfertigung durch und überwachten die Zellfertigung. An den Patienten nahmen RGM, SR, LMS, RMR, VB, J. Moon, AR, EHN, CB, J. Mahdi, CE, SG, LR, TTC, S. Partap, PGF, CJC, GG, KLD, CLM und MM teil Pflege. KWY las Röntgenbilder und führte eine volumetrische Analyse von MRT-Scans durch. IJC, MCR, CB, J. Moon., MK und MF beteiligten sich an der Sammlung und/oder Verarbeitung von Patientenproben. ACG, VB, RGM, ZE, WR, SK und BS führten korrelative Studien durch. ACG führte eine GD2-Gewebefärbung durch und entwarf und führte die RNAscope-In-situ-Hybridisierung durch. VB hat den ctDNA-Assay entworfen und durchgeführt. SR, LJ, RM, ZG, AYM, SMG und MGF analysierten scRNA-seq-Daten. S. Prabhu., SR, VB, ACG, RGM, MM und CLM analysierten andere korrelative Studien. AMST und HV führten die Gehirnautopsie von Patient 1 mit DIPG durch und führten eine neuropathologische Untersuchung und immunhistochemische Analysen des Autopsiegewebes durch. RGM, SR, MM und CLM erstellten Abbildungen und verfassten das Manuskript. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und bearbeitet. MM und CLM überwachten alle Aspekte der Arbeit.

Korrespondenz mit Crystal L. Mackall oder Michelle Monje.

Die Stanford University ist dabei, einen Patentantrag für die Behandlung von H3K27M-mutierten Gliomen mit GD2-CAR-T-Zellen zu stellen, in dem MM, CLM, RGM und CWM als Erfinder aufgeführt sind. CLM ist Mitbegründer und hält Anteile an Lyell Immunopharma und Syncopation Life Sciences, die CAR-basierte Therapien entwickeln, sowie an Red Tree Venture Capital, Ensme und Mammoth und berät Lyell, Syncopation, Red Tree, NeoImmune Tech, Apricity, Nektar, Immatics, Ensoma und Mammut. RGM ist Mitbegründer und Anteilseigner von Syncopation Life Sciences; Er ist außerdem Berater für Lyell Immunopharma, Syncopation Life Sciences, NKarta, Gamma Delta Therapeutics, Aptorum Group, Illumina Radiopharmaceuticals, ImmunAI, Arovella Therapeutics und Zai Lab. MM ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Cygnal Therapeutics.

Nature dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a: MRT-Bilder (axiales T2) von Teilnehmer 1 mit DIPG (DIPG-1) vor und am 28. Tag nach der GD2-CART-Infusion zeigten keine Verbesserung. b: Veränderung des Tumorvolumens im Laufe der Zeit in DIPG-1. c: Postmortales Pons-Tumorgewebe von DIPG-1 zeigt durch Immunhistochemie Hinweise auf CD4+- und CD8+-T-Zellen (braun). Die CD4+-Färbung des nicht betroffenen Kortex zeigt seltene leptomeningeale vaskuläre CD4+-Zellen und dient als interne Positivkontrolle. d, RNAscope-Sonde gegen die GD2-CAR-Konstrukt-mRNA identifiziert GD2-CAR-T-Zellen (GD2-CAR-mRNA-Punkte, rosa). Zur Validierung der RNAscope-Sonde wurden positive GD2-CAR-T-Kontrollzellen in Gewebekultur und ein negativer Kontrollkortex eines DIPG-Patienten, der nicht mit CAR-T-Zellen behandelt wurde, verwendet. Die mit RNAscope nachgewiesene GD2-CAR-mRNA-Expression identifizierte GD2-CAR-T-Zellen im Tumorgewebe von DIPG-1. GD2-CAR mRNA puncta = rosa, Hämatoxylin-Gegenfärbung für alle Zellen = blau. e: Normales menschliches Muskelgewebe, immungefärbt auf GD2, als Negativkontrolle für die GD2-Antigen-Immunhistochemie. f, CD163+ myeloische Zellen (braun) im Tumorgewebe von DIPG-1 durch Immunhistochemie. Die CD163-Immunfärbung des nicht betroffenen Kortex zeigt Mikrogliazellen in ihrer „ruhenden“ perivaskulären Position. CD163+-reaktive Mikroglia/Makrophagen waren im normalen Kortex von DIPG-1 nicht erkennbar. g: Konfokale Mikroskopie von DIPG-1-Tumorgewebe, das bei der Autopsie gewonnen wurde, zeigt, dass signifikante myeloische Zellen (Iba1+-Zellen, grün) den Tumor infiltrieren (H3K27M+-Zellen, rot). Maßstabsbalken = 100 Mikrometer.

Quelldaten

a: Teilnehmer 2 mit DIPG (DIPG-2) MRT-Bilder (axiales T2) auf der Höhe des Mittelpons zeigen eine T2-Signalanomalie im Trigeminuskern (roter Pfeil), die sich am Tag verschlechterte (erhöhtes T2-Signal, konsistent mit Pseudoprogression). +7 und nahm bei den Scans an Tag+14 und Tag+21 zunehmend ab. Zusammen mit dieser T2-Signaländerung verschlechterte sich die Trigeminusfunktion (Kaumuskeln und linke Gesichtsempfindung) um Tag+7 herum und verbesserte sich dann klinisch zunehmend. Die Größe der intratumoralen Zyste in der Nähe des Trigeminuskerns nahm nach der Behandlung ab (rote Pfeilspitze) und Größe und Form des vierten Ventrikels normalisierten sich. b: Veränderung des Tumorvolumens im Laufe der Zeit bei DIPG-2. c: MRTs (axiales T2) des Kleinhirns von Teilnehmer 3 mit DIPG (DIPG-3) zeigen im Laufe der Zeit trotz GD2-CAR-T-Zell-Behandlungen eine zunehmende Erkrankung des Kleinhirns. Die Erkrankung im Kleinhirnstiel war 1 Monat nach der IV-Infusion relativ stabil, aber zum Zeitpunkt der ICV-Infusion (neue ICV-Basislinie, untere Reihe) hatten der Kleinhirnstiel und die Kleinhirnerkrankung zugenommen, was mit dem Fortschreiten des Tumors an dieser Stelle übereinstimmt. d, Patient 1 mit Rückenmarks-DMG (Spinal DMG-1) MRT-Gehirn (axiales T2) vor und 21 Tage nach der Verabreichung von ICV-GD2-CAR-T-Zellen. Beachten Sie die ausgedehnte Ausbreitung des Tumors im gesamten Gehirn, die sich nach der ICV-Behandlung verringerte (siehe beispielsweise Pfeile am linken unteren Frontallappen, die die verringerte infiltrative Erkrankung an Tag 21 hervorheben).

Quelldaten

Das Elektroenzephalogramm (EEG) zeigt eine diffuse Verlangsamung mit triphasischen Wellen am Tag 2–3 nach der Verabreichung von ICV-GD2-CAR-T-Zellen in spinalem DMG-1. In Übereinstimmung mit diesem EEG-Muster, das häufig bei reversibler toxischer/metabolischer/inflammatorischer Enzephalopathie beobachtet wird, kehrte der Geisteszustand im Laufe der Tage auf den Ausgangswert zurück.

a, Erhöhte Laktatdehydrogenase (LDH)-Spiegel etwa 7–14 Tage nach GD2-CAR-T-Zell-Infusionen (entweder IV oder ICV) bei N = 4 Patienten. Ausgefüllter Punkt=IV, offener Punkt=ICV. b: Zellfreie Tumor-DNA (ctDNA) aus dem Liquor des Patienten wurde mittels digitaler Droplet-PCR auf die H3K27M-Mutation im H3F3A-Gen untersucht. N = mindestens 4 technische Replikate, dargestellt als Log2 der Mutationen pro ml CSF ± SEM. Jeder Punkt entspricht einem technischen Replikat zum angegebenen Zeitpunkt; Ausgefüllter Punkt=IV, offener Punkt=ICV. DIPG-2 und Spinal DMG-1 zeigten einen Anstieg der cfDNA-Spiegel direkt nach der GD2-CAR-T-Zell-ICV-Infusion (p < 0,0001, berechnet durch t-Test). Hier sind alle verfügbaren Liquorproben von Patienten mit ausreichender DNA-Extraktion dargestellt. DIPG-1 und DIPG-3 lagen unterhalb der Nachweisgrenze und werden nicht angezeigt (Nachweisgrenze = 1 Mutation pro ml). c, Arbeitsablauf für den zellfreien Tumor-DNA-Assay (ctDNA). Zellfreie DNA (cfDNA) wurde aus 1–4 ml CSF extrahiert und einer 7-Zyklen-Voramplifikation gefolgt von 40 Zyklen digitaler Droplet-PCR (ddPCR) unterzogen. Schaltplan erstellt mit BioRender.com. d, Repräsentative Bioanalysatorspuren von Patienten zeigen ausreichende cfDNA-Mengen in Spinal DMG-1 und DIPG-2 ohne nachweisbare cfDNA in DIPG-1 und DIPG-3 (d. h. es war nicht genügend zellfreie Gesamt-DNA vorhanden, um den Test durchzuführen). e: Die Validierung des ddPCR-Assays durch serielle Verdünnung des mutierten H3K27M-gBlocks (IDT) vor einem festen Hintergrund des Wildtyp-H3K27M-gBlocks zeigt den linearen Nachweis des mutierten H3K27M-gBlocks. Probenkonzentrationen (Kopien/ul) und Verdünnungsfaktoren werden im Log10-Maßstab aufgetragen. Die QuantaSoft Pro-Software berechnet die Ausgangskonzentration jedes Ziel-DNA-Moleküls durch Modellierung als Poisson-Verteilung; Die für die Poisson-Modellierung verwendete Formel lautet: Kopien pro Tröpfchen = -ln(1-p), wobei p = Anteil der positiven Tröpfchen. f: Der Einschluss von Negativ- und Positivkontrollen für jeden ddPCR-Assay wurde neben den Patientenproben durchgeführt. Vorverstärktes Wasser diente bei jedem Lauf als Negativkontrolle. Als Positivkontrolle wurde konditioniertes Medium aus H3K27M-mutierten DIPG-Zellkulturen verwendet. Serielle Verdünnungen von H3K27M-mutiertem DIPG-Zellkulturmedium zeigen eine reproduzierbare Varianten-Allel-Häufigkeit (VAF) der Positivkontrolle.

Quelldaten

a, Zeitverlauf von entzündungshemmenden Mitteln (Tocilizumab, Anakinra und Kortikosteroide), die Patienten nach CAR-T-Zell-Infusionen verabreicht wurden, grafisch dargestellt, um einen Kontext für die Interpretation der Zytokinspiegel zu verschiedenen Zeitpunkten bereitzustellen. b–d, Dieselben Daten in absoluten Werten, die in Abb. 4 in Heatmap-Form dargestellt sind. Jeder Datenpunkt stellt den pg/ml-Wert des angegebenen Zytokins zum Zeitpunkt nach der GD2-CAR-T-Zell-Infusion dar. b, Proinflammatorische Zytokinspiegel im Blut und in der Liquor cerebrospinalis (CSF) nach intravenöser (IV) Verabreichung. N = 4 Patienten (Blut) und 3 Patienten (CSF). c, Proinflammatorische Zytokinspiegel im Blut und in der Liquor cerebrospinalis (CSF) nach intrazerebroventrikulärer (ICV) Verabreichung. N = 3 Patienten. d, Immunsuppressive TGFβ-Zytokinspiegel im Liquor nach intravenöser CAR-T-Zell-Verabreichung. N = 3 Patienten. e, Spitzenwerte von IL1-Ra im Serum und Liquor während der Anakinra-Behandlung. Anakinra ist rekombinantes IL1-Ra. Der Liquorspiegel von Anakinra, das die Blut-Hirn-Schranke überwinden kann, betrug etwa ein Zehntel des Serumspiegels. Daten, die durch Luminex-Multiplex-Zytokinanalyse von Blutplasma- und Liquorproben von Patienten generiert wurden. N = 3 Patienten. b–e, Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert zweier technischer Replikate dar. Rot=DIPG-1, Blau=DIPG-2, Lila=DIPG-3, Grün=Wirbelsäulen-DMG-1. Ausgefüllter Punkt=IV, offener Punkt=ICV.

Quelldaten

a, Schematische Darstellung der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) über die 10X Genomics-Plattform, durchgeführt an sortierten GD2-CAR+- und CAR--Infusionsprodukten sowie CSF-Proben zu angegebenen Zeitpunkten während der Behandlung. Es wurden 65.598 Einzelzellen sequenziert, darunter 20.000 Einzelzellen aus der CAR+-Fraktion von Patientenprodukten und 25.598 Zellen aus dem Liquor des Patienten (dargestellt in Abb. 4). Schaltplan erstellt mit BioRender.com. b: GD2-CAR+-T-Zellen wurden nach der Verabreichung von GD2-CAR-T-Zellen in Liquorproben von DIPG-2 und spinalem DMG-1 nach der Behandlung identifiziert. T-Zellen mit nachgewiesener GD2-CAR-Expression werden als rote Punkte dargestellt. Eine einzelne UMAP wurde mit durchflusssortiertem GD2-CAR-T-Zellprodukt und Zellen aus dem Liquor erstellt und dann je nach Tag der Probe einzeln visuell dargestellt. Beachten Sie die Veränderungen im GD2-CAR-T-Zellprofil im Laufe der Zeit. Für spinales DMG-1 wurden nach intravenöser Infusion keine CSF-Studien durchgeführt. Auch bei DIPG-3 waren die Liquorstudien begrenzt: Nach der Verabreichung von ICV-GD2-CAR-T-Zellen war bei DIPG-3 während der Zeit des Höhepunkts der Entzündung keine Liquordrainage erforderlich, und angesichts ihres jungen Alters war die elektive Liquorsammlung eingeschränkter. Daher war der einzige Post-ICV-Zeitpunkt für die CSF-Sammlung aus DIPG-3 Tag 14, an dem zu diesem Zeitpunkt nicht genügend Zellen im CSF vorhanden waren, um scRNAseq durchzuführen. Blauer Pfeil = IV-Infusion, gelber Pfeil = ICV-Infusion. c, Vulkandiagramm, das das CAR-T-Zellprodukt von DIPG-1 im Vergleich zu DIPG-2 darstellt. d–f, Genontologie-Termanalyse der am signifikantesten angereicherten Signalwege im DIPG-1CAR+-Produkt im Vergleich zu DIPG-2 (d), Spinal DMG-1 (e) und DIPG-3 (f) CAR+-Produkt vor der CAR-T-Zelle Verwaltung. Die y-Achse zeigt die erweiterten Gen-Ontologie-Begriffe, während die x-Achse („GeneRatio“) der Überlappung zwischen den hochregulierten Genen und den Genen entspricht, die mit den angegebenen Gen-Ontologie-Begriffen im Datensatz verknüpft sind. Die Farbe des Kreises entspricht der p-Wert-Signifikanz der Signalweganreicherung im Verhältnis zu allen anderen Genen im Datensatz. Die Größe des Kreises entspricht der relativen Anzahl übereinstimmender hochregulierter Gene im angegebenen Begriff der Genontologie.

a: Kreisdiagramme stellen die CD4:CD8-Verhältnisse von Liquor-T-Zellen von Patienten zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Verabreichung von CAR-T-Zellen dar. b, oberes Feld: CSF-T-Zell-UMAP-Projektionen, die Tregs in scRNA-seq-Daten hervorheben. Der Treg-Zellcluster ist lila hervorgehoben, während alle anderen T-Zellen grau gefärbt sind. Unteres Feld: UMAP-Projektionen, die Tregs in scRNA-seq-Daten durch Expression kanonischer Markergene von Tregs (CD4, FOXP3, CD25 und IKZF2) hervorheben.

Quelldaten

a: UMAP-Projektionen myeloischer Zellen im Liquor, die myeloische Zellcluster in scRNA-seq-Daten durch die am besten differentiell exprimierten Gene jedes Zellclusters hervorheben. b, c, Expression myeloischer Transkriptionssignaturgene (y-Achse) identifizierter myeloischer Zellcluster (x-Achse). Die Punktgrößen stellen den Prozentsatz der Zellen dar, die das Gen im gegebenen Cluster exprimieren. Die Farbskala zeigt den skalierten Durchschnittsausdruck. Dargestellt sind Gene mit immunaktivierenden und supprimierenden (b), homöostatischen und DAM-Signaturen der Stufen 1 und 2 (c).

a–c: Die Genontologie-Termanalyse zeigt die am signifikantesten aktivierten Signalwege in der myeloischen Fraktion von DIPG-1 im Vergleich zu DIPG-2 (a), DIPG-3 (b) und spinalem DMG-1 (c). d: Die Genontologie-Termanalyse zeigt die signifikantesten angereicherten Signalwege in der myeloischen Fraktion der DIPG-2-CSF-Probe am 8. Tag der intravenösen CAR-T-Verabreichung im Vergleich zur myeloischen Fraktion der DIPG-2-CSF-Probe am zweiten Tag der ICV-CAR-T-Zellverabreichung (Zeitpunkte des Höhepunkts der Entzündung nach intravenöser oder ICV-Verabreichung bei diesem Patienten). Die y-Achse zeigt die erweiterten Gen-Ontologie-Begriffe, während die x-Achse („GeneRatio“) der Überlappung zwischen den hochregulierten Genen und den Genen entspricht, die mit dem angegebenen Gen-Ontologie-Begriff im Datensatz verknüpft sind. Die Farbe des Kreises entspricht der p-Wert-Signifikanz der Signalweganreicherung im Verhältnis zu allen anderen Genen im Datensatz. Die Größe des Kreises entspricht der relativen Anzahl übereinstimmender hochregulierter Gene im angegebenen Begriff der Genontologie. In diese Analyse werden nur myeloische Zellen im Liquor einbezogen.

a: Repräsentatives Gating einer Patienten-CSF-Probe mittels Durchflusszytometrie (identisches Gating wurde für aus Blut gewonnene PBMC verwendet). b: Gating von Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie aus Temporallappenresektionsgewebe aus spinalem DMG-1.

Diese Datei enthält das klinische Studienprotokoll.

Diese Datei enthält die Ergänzungstabellen 1–10.

Ausgangsgang bei Teilnehmer mit DIPG 2 (DIPG-2) vor der intrazerebroventrikulären GD2-CAR-T-Zell-Infusion. Ganguntersuchung am Tag der Aufnahme vor der CAR-T-Zell-Infusion (T0). Der Gang ist breitbasig und leicht instabil, mit vermindertem Schwung des rechten Arms und Zirkumduktion der rechten unteren Extremität. Er braucht mehrere (6) Schritte, um sich umzudrehen. Er geht auf Zehenspitzen durch den Raum zurück, dreht sich dann mit mehreren Schritten erneut um und versucht, einen Tandemgang auszuführen, schafft es aber nicht. Videos, die mit Einverständniserklärung aufgenommen und veröffentlicht wurden.

Gang bei Teilnehmer mit DIPG 2 (DIPG-2) zwei Wochen nach der intrazerebroventrikulären GD2-CAR-T-Zell-Infusion. Am Tag +14 nach der ICV-GD2-CAR-T-Zell-Infusion ist der Gang deutlich verbessert, mit schmalerer Basis, erhöhter Geschwindigkeit, verbesserter rechter Zirkumduktion und verbessertem Armschwung. Beachten Sie das verbesserte Drehen (zwei Schritte). Videos, die mit Einverständniserklärung aufgenommen und veröffentlicht wurden.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Majzner, RG, Ramakrishna, S., Yeom, KW et al. GD2-CAR-T-Zelltherapie für H3K27M-mutierte diffuse Mittelliniengliome. Natur 603, 934–941 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-04489-4

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Eingegangen: 02. August 2021

Angenommen: 28. Januar 2022

Veröffentlicht: 07. Februar 2022

Ausgabedatum: 31. März 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-04489-4

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